提高毕赤酵母发酵产磷脂酶c产量的培养基及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及磷脂酶C制备领域，具体的，涉及一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产 量的培养基及方法。
【背景技术】
[0002] 磷脂酶C (phospholipase C，简称PLC)是一类可催化水解磷脂C3的磷脂酰键的 水解酶。其水解产物甘油二酯是一种生理活性物质，在细胞信号传导途径上起着第二信使 的作用，能激活蛋白激酶C (PKC)而引起细胞增殖、分化、收缩、分泌和代谢等功能变化，此 外还具有明显的抗血小板粘附、聚集等功能，对抗血小板新型药物及抗静脉血栓医疗方面 的研究意义重大。随着对PLC研究的深入及工业发展的需求，PLC的应用价值已经从药品生 产延伸到油脂精炼、食品加工、磷脂改性等领域，如：植物油脱胶，面包改性等。而最近PLC 作为一种新型食品添加剂势必会推动PLC的广泛应用和研究。
[0003] 国外对微生物磷脂酶C的研究起源于20世纪60年代，迄今已有多种微生 物来源磷脂酶C的基因序列、蛋白结构及催化机理公布于众。产磷脂酶的细菌中 Bacillus cereus、C. bifermentants、C. perfringens、L monocytogenes、Ρ· aeruginosa、 B. thuringiensis来源磷脂酶C的基因已经克隆并对其底物特异性及酶学性质等进行了较 为深入的研究。其中，B. cereus来源的PLC是一种分子量为23000KD的胞外酶，含有2个锌 离子，是一种锌离子依赖型的单金属酶，其酶活和稳定性都依赖于锌离子（Clive little. Effect of some divalent metal cations on phopholipase C from Bacillus cereus. Acta Chemica Scandinavica B35 (1981) 39-44)。此外，还有研究者发现（Clive little and anne-brit otnass. The metal ion dependence of phospholipase C from bacillus cereus. Biochimica et Biophysica Acta, 391 (1975)326-333. Abramo C. Ottolenghi. Phospholipase C from bacillus cereus A zinc requiring metalloenzyme. Biochim. Biophys.Acta. 106(1965), 510-518. Clive little and sissel johansen. Unfolding and refolding of phospholipase C from Bacillus cereus in solutions of guanidinium chloride. Biochem.J. (1979) 179, 509-514. Anne-Brit otnaess,Clive little,knut sletten，et al. Some characteristics of phospholipase c from bacillus cereus. Eur. J. Biochem. 79,459-468(1977)) :B. cereus 来源的 PLC 中一个锌离子与酶蛋白紧密 结合，另一个比较松散，容易被其他二价金属离子取代，从而造成酶活降低或失活。目前， B. cereus来源的PLC在毕赤酵母中表达的研究比较少，目前主要有Kook等（Kook-Hwa Seo&Jong Rhee. High level expression of recombinant phopholipase C from Bacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization. Biotechnology Le tters26:1475-1479, 2004)将 B. cereus 来源的 PLC 基因在毕赤酵母（P. pas tor is)进 行表达，摇瓶水平上检测了酶活。美国Verenium公司将包括B. cereus来源在内的任 何来源的PLC基因在毕赤酵母中的表达都做了保护，并提出了"高的共喂料速率"策略 (CN101558154A)。
[0004] 目前，巴斯德毕赤酵母表达体统在国内外的应用非常广泛，迄今已有500多种外 源蛋白在毕赤酵母中获得成功表达（Sue Macauley_Patrick，Mariana L.Fazenda, Brian McNeil and Linda M. Harvey. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J]. Yeast, 2005, 22 ：249-270.)。通常外源蛋白在毕赤酵母 中表达所用培养基及调控策略都基本都采用Invitrogen公司的操作手册上培养基及调控 方式，即：基础盐培养基主要包括硫酸钙，硫酸钾，硫酸镁，甘油等。调控方式分甘油长菌体， 和甲醇诱导产外源蛋白阶段。最近，部分学者认为，Irwitrogen公司提供的培养基配方中 基础盐浓度过高，导致培养基总渗透压过高，致使菌体过早死亡，释放大量蛋白酶，是造成 毕赤酵母表达外源蛋白过程中外源目的蛋白降解的主要原因。如：Surribas等（Surribas A, Stahn R, Montesinos J L, et al. Production of a Rhizopus oryzae lipase from Pichia pastoris using alternative operational strategies. Journal of Biotechnol ogy, 2007, 130(3) :291-299)将基础盐浓度降至原来的1/4时，菌体死亡率大大下降。Zhao 等（Zhao H L, Xue C,ffang Y, et al. Increasing the cell viability and heterologous protein expression of Pichia pastoris mutant deficient in PMRlgene by culture condition optimization. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81 (2) :235-241)将基础盐 浓度降至原来的1/4时，诱导前后菌体死亡率分别降低83. 3%和48. 6%?59. 2%，蛋白表达 量提1? 92%。
【发明内容】
[0005] 发明人在研究中，意外发现在使用毕赤酵母表达錯状芽孢杆菌（B. cereus)来源的 PLC时，控制培养基中的Mg2+含量为I. 5-4. 6g/l，发酵过程中的蛋白酶含量得到有效抑制， 目的蛋白磷脂酶C的产酶时间被有效延长，且稳定性得到大幅提高，最终获得发酵液中的 PLC的酶活得到较大提高，甚至可提高4倍以上。
[0006] 因此，本发明的一个目的在于，提供一种用于毕赤酵母表达PLC的发酵培养基。
[0007] 本发明提供的发酵培养基，其中Mg2+含量为I. 5-4. 6g/l。
[0008] 在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基中，Mg2+含量为2. 3-4. 6g/l，优选为 2. 3 ?3. 4g/L。
[0009] 在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于无机盐、有机盐或其组合。
[0010] 在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于MgSO4, MgSO4. 7H20, MgCl2, MgCO3, Mg(HCO3)2, Mg(GH3COO)2 · 4H20 中的一种或多种。
[0011] 在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
[0012] 30 ?50g/L 甘油，0· 6 ?I. 2g/L CaSO4,10 ?20g/L K2S04,6 ?12g/L(NH4)2S04， 0. 1?0. 2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3?5ml/L微量元素浓缩溶液。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，发酵培养基中还包含：
[0014] 30-50g/L 甘油，15-30ml/L 磷酸，0· 6-1. 2g/L CaSO4, 15-20g/L K2SO4, 3-5g/LK0H， 0. 1?0. 2ml/L消泡剂，3?5ml/L微量元素浓缩溶液。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。 在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为PTMl微量元素浓缩溶液或PTM4 微量元素浓缩溶液。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，所述PTM微量元素浓缩溶液为：5. 99g/L CuS045H20， 8ml/Ll%NaI,3. Og/L MnSO4H2O, 0. 2g/L Na2Mo4. (H2O) 2,0. 5g/L CoCl2 (H2O) 6, 20. 04g/L ZnCl2(H20)5,65.05g/L FeSO4. (H20)7,800 yL/L 2.5%H3B03，19.2ml/L 浓硫酸，0.4g/L 生物 素。
[0017] 在本发明的一个实施例中，使用的消泡剂为聚醚类消泡剂、高碳醇、硅类中的一种 或多种。
[0018] 本发明还提供了一种提高毕赤酵母发酵产磷脂酶C产量的发酵培养基，该发酵培 养基通过将常规培养基中Mg 2+调节至I. 5-4. 6g/l而获得。
[0019] 在本发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，Mg2+含量为2. 3?4. 6g/l，在本 发明的一个实施例中，在所述发酵培养基中，Mg2+含量为2. 3?3. 4g/L。
[0020] 在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于无机盐、有机盐或其组合。
[0021] 在本发明的一个实施例中，所述Mg2+来源于MgSO 4, MgSO4. 7H20, MgCl2, MgCO3, Mg(HCO3)2, Mg(GH3COO)2 · 4H20 中的一种或多种。
[0022] 在本发明的一个实施例中，所述常规培养基为用于毕赤酵母发酵的培养基。在本 发明的一个的实施例中，使用的培养基为基础盐培养基或改良培养基，在一个优选的实施 例中，使用的基础盐培养基为FM21或BSM，在另一个优选的实施例中，使用的培养基为FM21 或BSM的改良培养基。
[0023] 在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
[0024] 30 ?50g/L 甘油，0· 6 ?I. 2g/L CaSO4,10 ?20g/L K2S04,6 ?12g/L(NH4)2S04， 0. 1?0. 2ml/L消泡剂，20-30g/L六偏磷酸钠，3?5ml/L微量元素浓缩溶液。
[0025] 在本发明的一个实施例中，发酵培养基中还包含：
[0026] 30-50g/L 甘油，15-30ml/L 磷酸，0· 6-1. 2g/L CaSO4, 15-20g/L K2SO4, 3-5g/LK0H， 0. 1?0. 2ml/L消泡剂，3?5ml/L微量元素浓缩溶液。
[0027] 在本发明的一个实施方案中，所述微量元素浓缩溶液为PTM微量元素浓缩溶液。 在本发明的一个实施方案中，所述PTM微