一种口蹄疫病毒的灭活剂及其灭活方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种口蹄疫病毒的灭活剂及其灭活方法。
【背景技术】
[0002]口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。口蹄疫的暴发将严重影响到一个国家的经济发展、国际贸易、社会稳定和国际声誉。因此，素有“政治经济病”之称，被联合国粮农组织(FAO)、世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物传染病之首，并列入重大跨国动物疫病全球消灭行动计划，也是我国必须强制免疫的重大动物疫病之一。
[0003]全世界对于FMD的控制与消灭，依据不同的国情和经济实力，目前可归纳为两种模式。经济发达，已消灭了 FMD的国家大多采用强制扑杀、控制动物移动和疫情监测的果断措施“扑灭”FMD，其余均采用以灭活疫苗预防免疫为主和扑杀相结合的温和措施。因此，疫苗免疫是口蹄疫诸多防制措施中最重要、也是最成功的措施之一，尤其对尚未扑灭口蹄疫的发展中国家，更是如此。
[0004]国际上曾研宄应用和正在研制的FMD疫苗综括起来有弱毒疫苗、灭活疫苗和新型疫苗三大类。从口蹄疫疫苗的整个研宄和应用情况看，弱毒疫苗由于存在毒力返祖风险、不利于查源灭疫、容易形成持续性感染等缺陷，已经被完全摈弃。新型疫苗虽然取得一些非常有前途的结果，但在免疫效力和经济上无法与常规疫苗相媲美。常规灭活疫苗仍然是当前口蹄疫免疫防控的最主要疫苗。
[0005]灭活疫苗，顾名思义就是要将具有感染性的活的病原体用适当的物理或化学方法灭活，使其丧失了致病性，但仍保留其免疫原性，用其制造的疫苗。因此，选择适当的灭活剂，对口蹄疫病毒进行灭活是灭活疫苗制造的重要环节，肩负着第一使病原体彻底失活，第二最大程度的保留免疫原性双重责任。综括起来，其发展经历了以下几个历程:①福尔马林(formaidehyde, FA)。多年来一直用0.02?0.10%福尔马林溶液调pH值至7.6?9.2后，于23?26°C下灭活FMDV，其灭活速度约为0.30Logl0/小时。但是，由于福尔马林是通过病毒蛋白交联而使病毒被灭活的，对病毒RNA并没有本质的改变，其灭活过程不遵循一级动力学(first order kinetics)，难以确定反应到何时才能保证其安全，因而灭活不完全的现象时有发生。曾经证明，有些国家口蹄疫的爆发与此类灭活疫苗中残留活病毒密切相关。此外，病毒液中的水解乳蛋白和Tris缓冲液能够抑制福尔马林的活性(Barteling，1984 ;Brown，2001)。② Beta—propr1lactone (BPL)。该灭活剂虽然可对 FMDV 迅速灭活，但它可使病毒液的PH值迅速下降，从而导致病毒完全变性，146S有效抗原降解殆尽，因此不适合于FMDV的灭活。③氮丙啶(aziridine)类化合物。主要包括乙酰乙稀亚胺(acetylethylamine，AEI)及它的同类衍生物二乙稀亚胺(binary etylethylamine，ΒΕΙ)，二者均直接作用于病毒的RNA，使FMDV迅速灭活，并且灭活过程遵循一级动力学，可准确测定最低灭活安全水平。尤其BEI，不仅对FMDV具有良好灭活性能，而且相对于AEI，毒性更低，在适宜条件下灭活速度可达到0.50?1.0OLoglO/小时。因此，迄今国内外疫苗生产企业一直使用其灭活FMDV。用BEI灭活口蹄疫病毒时，首先将病毒液的pH值调至8.0左右，加入BEI，使其终浓度为0.001?0.002moL，升温至30°C连续灭活24小时即可。大规模工业化FMD疫苗生产流程一般是管道化生产，管道拐角、罐体犄角等死角处有可能滞留无法与灭活剂充分接触的FMDV，留下安全隐患。因此，为确保所有制苗病毒抗原均被彻底灭活，通常需要进行二次灭活。即，将病毒液经过24小时的一次灭活后，将其装入另外一个容器中，再次添加灭活剂，在相同条件下继续进行另外24小时的二次灭活。如此一来，实际灭活总时间是48小时，在此过程中，可使146S有效抗原丢失10?30%。
【发明内容】
[0006]由于现有FMDV灭活方法对口蹄疫病毒的灭活速率较低、所需灭活时间较长、灭活过程中146S有效抗原损失比较严重，因此，本发明旨在建立以BEI和FA双灭活剂为核心的FMDV灭活剂和灭活方法，在保证灭活绝对安全的前提下，提高灭活速度、缩短灭活时间，降低146S有效抗原的损失，从而达到缩短疫苗生产周期、降低疫苗生产成本、提高疫苗免疫效力的目的，以满足在更短的时间对口蹄疫疫苗进行工业化大生产的要求。
[0007]本发明提供了一种口蹄疫病毒灭活剂，所述灭活剂为BEI和FA0
[0008]作为优选，所述灭活剂中，BEI的终浓度为0.002mol/L，FA的终浓度为0.05% (v/V)。此时，灭活效果最好。
[0009]本发明还提供上述口蹄疫病毒灭活剂的制备方法，是在BEI溶液中加入FA溶液制备得到的。
[0010]本发明的第三个目的是提供上述灭活剂在灭活口蹄疫病毒中的应用。
[0011]本发明的第四个目的是提供上述灭活剂在制备灭活口蹄疫疫苗中的应用。
[0012]本发明的第五个目的是提供一种灭活口蹄疫病毒的方法，步骤如下:是将待灭活的口蹄疫病毒液先用权利要求1或2所述的灭活剂进行5.5-6小时的一次灭活，再将经一次灭活的病毒液装入另外一个容器中，用权利要求1或2所述的灭活剂进行另外5.5-6小时的二次灭活，灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的终浓度为2%的硫代硫酸钠溶液(50%)进行阻断。
[0013]本发明的第六个目的是提供一种灭活口蹄疫疫苗的制备方法，步骤如下:
(1)抗原制备:将用灭活剂BEI和FA灭活好的抗原，按现行《中国兽药典》进行无菌检验，并用2-4日龄的乳鼠进行安检；无菌检验和安检合格后，作为制苗用抗原2?8°C下保存备用；
(2)佐剂制备:采用MontanideISA 206佐剂，或按照以下质量百分比:司班80:吐温:白油=18%:7%:75%的成分及比例配制佐剂，15镑高压灭菌15-20分钟后，室温下保存备用；
(3)疫苗配制:按佐剂:抗原的比例为1:1混匀，一次性通过均质机乳化成油乳剂疫苗。
[0014]单独使用BEI作灭活剂的现有口蹄疫病毒灭活方法，其主要缺点是:1)灭活速率低。据报道为0.50?1.0OLog10/小时；本专利所进行的单独使用BEI作灭活剂的对比实验结果为0.51?0.59 Log10/小时。2)所需灭活时间长。据报道一次灭活需要24小时，二次灭活同样需24小时，两次至少共需48小时，即2个工作日。根据本专利所进行的单独使用BEI作灭活剂的对比实验结果，一次灭活至少需21小时。3) 146S有效病毒抗原损失严重。据报道(Simon J etal)，在30±1°C下，经过48小时的持续灭活，病毒液中146S有效病毒抗原损失10?30%。
[0015]本发明为优化灭活工艺、缩短灭活时间、降低146S有效病毒抗原的丢失，参考OIE及国际上先进的FMDV灭活工艺技术，研制出了一种以BEI和FA双灭活剂为核心的FMDV灭活新技术。从而达到缩短疫苗生产周期、降低疫苗生产成本、提高疫苗免疫效力的目的，以满足在更短的时间内对口蹄疫疫苗进行工业化大生产的要求。
[0016]灭活动力学试验表明，本发明对0、A、亚洲I型FMDV的灭活率均数为2.06?2.HLog10/小时，而单独使用BEI作灭活剂的现有技术对0、A、亚洲I型FMDV的灭活率均数为0.51?0.59Log1Q/小时。因此，本发明的灭活速度比现有技术提高了约35倍以上。依据全部灭活批量中用于安全性检验的试样所占的比例，对于100L批量在-5.0LogltlTCID5ci以下可确定为最低灭活安全水平，用该工艺灭活0、A、亚洲I型FMDV，达到该水平所需的灭活时间在4.76?5.19小时之间。鉴于对病毒灭活的安全性在FMD疫苗生产及使用中的重要性，将这3种FMDV的灭活时间定为5.5-6小时，以确保所有病毒均被彻底灭活。在大规模工业化生产中，为规避管道、罐体犄角等死角处可能滞留的病毒由于无法与灭活剂充分接触而不能被彻底灭活，污染已灭活的制苗用病毒抗原，在完成5.5-6小时的一次灭活后，拟进行另外5.5-6小时二次灭活。即便如此，所需灭活总时间才11-12小时，完全可以在一个工作日内完成。此外，由于FA本身也是一种常用灭活剂，尽管它对FMDV的灭活效果不理想，灭活速度仅仅为0.3 Log10 /小时，但是，由于福尔马林还是一种蛋白交联剂，它可使FMDV的衣壳蛋白相互交联而变得更加稳定，从而使146S有效抗原跟灭活前比几乎没有损失。如前所说，FA本身对FMDV的灭活速度很低，但将其与BEI同时使用时，为何会显著增加BEI的灭活速度，尚不得而知，估计可能与FA对病毒得不得交联作用有关。
【附图说明】
[0017]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为口蹄疫O型病毒灭活动力曲线(BEI)；
图2为口蹄疫O型病毒灭活动力曲线(BEI+FA)；
图3为口蹄疫A型病毒灭活动力曲线(BEI)；
图4为口蹄疫A型病毒灭活动力曲线(BEI+FA)；
图5为口蹄疫Asial型病毒灭活动力曲线(BEI)；
图6为口蹄疫Asial型病毒灭活动力曲线(BEI+FA)。
【具体实施方式】
[0018]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0019]实施例1对O型FMDV的灭活一、灭活剂的配制: 1)0.2mol/L氢氧化钠的制备方法:无菌称取氢氧化钠16g，加双蒸水至2000mL，充分摇匀，高压灭菌。
[0020]2)BE1-FA双组分灭活剂(可用于100L病毒液的灭活)的制备方法:无菌称取BEA(2-溴乙胺氢溴酸盐，2-Bromoethylamine hydromide, BEA)41g，加上述已配制好的 0.2mol/L氢氧化钠溶液至865mL，充分溶解，置37°C水浴中，当BEA溶液温度平衡到37°C时，开始计时，每15分钟摇振一次，共计I小时。此时BEA环化为BEI。环化结束后，加入净含量为37%的福尔马林溶液135mL。该BE1-FA混合溶液中，BEI的浓度为0.2moL/L，FA的浓度为5% (V/V)。BE1-FA必须临用前配制。
[0021]3) BEI单组分灭活剂(可用于100L病毒液的灭活)的制备方法:无菌称取BEA(2-溴乙胺氢溴酸盐，2-Bromoethylamine hydromide, BEA) 41g，加上述已配制好的0.2N氢氧化钠溶液至lOOOmL，充分溶解，置37°C水浴中，当BEA溶液温度平衡到37°C时，开始计时，每15分钟摇振一次，共计I