猪圆环病毒疫苗的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和兽医领域，具体地，本发明提供了一种兽用猪圆环病毒疫 苗、及其纯化方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒病是影响我国养猪业的主要疾病之一，有效疫苗免疫是控制猪圆环病 毒感染的关键。
[0003] 传统疫苗的生产方法，具有操作简单、工艺经济等特点，但得到的粗制疫苗中抗原 含量较低，且含有一些杂质（包括杂蛋白）和过敏性物质，易引起动物应激反应，且效价和 质量都不稳定。
[0004] 因此，本领域迫切需要研制和开发一种新的制备纯化的、精制的猪圆环病毒疫苗 的方法，从而获得免疫原性好、保护性强、毒副作用小的疫苗。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个发明目的就是提供一种经纯化的、免疫原性好、保护性强、毒副作用 小的猪圆环病毒疫苗及其制备方法。
[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种对猪圆环病毒进行纯化的方法，包括以下步 骤：
[0007] (a)提供待纯化的原料，所述原料为含猪圆环病毒的液态样品；
[0008] (b)将所述液态样品上样于离子交换柱，使得猪圆环病毒抗原结合于所述的离子 交换柱；
[0009] (C)用洗脱缓冲液对上样后的离子交换柱进行洗脱，从而获得含猪圆环病毒抗原 的洗脱液。
[0010] 在另一优选例中，步骤（a)中所述的原料为细胞培养的液态猪圆环病毒抗原。
[0011] 在另一优选例中，步骤（a)中的含猪圆环病毒的液态样品是经灭活处理的，较佳 地，所述的灭活处理包括β-丙内酯灭活。
[0012] 在另一优选例中，步骤（a)中的所述的液态样品是经微滤处理的。
[0013] 在另一优选例中，所述的液态样品是经浓缩处理后获得的浓缩液。
[0014] 在另一优选例中，步骤（b)中，包括选自下组的一个或多个条件：
[0015] ⑴上样液总体积与介质体积比为5-50 :1(较佳地为10-20 :1，更佳地为约 15:1)；
[0016] (ii)离子交换介质为Diamond X树脂；
[0017] (iii)平衡所用的溶液为浓度0· 5-1. 5M(如约0· 9M)NaCl的10-50mM(如约20mM) 的磷酸盐缓冲液。
[0018] 在另一优选例中，所述的离子交换介质选自下组Diamond X树脂。
[0019] 在另一优选例中，在步骤（c)中，上样完毕后使用含0· 09-0. 12M NaCl的10-50mM 磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，再使用含0. 8-2. OM NaCl的10-50mM磷酸盐缓冲液洗脱并收集 猪圆环病毒抗原。
[0020] 在另一优选例中，所述方法还包括以下步骤：
[0021] (d)将步骤（C)中获得的洗脱液，上样于凝胶色谱柱并进行层析，从而获得纯化 的、含猪圆环病毒的洗脱液。
[0022] 在另一优选例中，步骤（d)中凝胶色谱层析条件为：将获得的离子交换柱层析的 洗脱液上样于凝胶色谱柱，上样体积与介质体积比〇. 5-2 :1-3 (较佳地为约1:1. 5)，凝胶色 谱柱介质为Bestdex G25,上样完毕后使用0. OlM PBS缓冲液洗柱，收集猪圆环病毒抗原洗 脱峰。
[0023] 在另一优选例中，从凝胶色谱层析柱获得的洗脱峰含猪圆环病毒抗原，杂蛋白去 除率彡90%，抗原回收率彡80%。
[0024] 在另一优选例中，所述方法还包括：将纯化的猪圆环病毒与药学上可接受的载体 和任选的佐剂进行混合，从而制备疫苗组合物。
[0025] 在本发明的第二方面，提供了一种制备猪圆环病毒疫苗的方法，包括步骤：用本发 明第一方面所述的方法制备纯化的猪圆环病毒；和
[0026] 纯化的猪圆环病毒与药学上可接受的载体和任选的佐剂进行混合，从而制备疫苗 组合物。
[0027] 在本发明的第三方面，提供了一种纯化的猪圆环病毒，所述的猪圆环病毒是用本 发明第一方面任一方法所纯化获得的。
[0028] 在另一优选例中，所述的纯化的猪圆环病毒中，杂蛋白的含量< 10%，更佳地 d
[0029] 在本发明的第四方面，提供了一种疫苗组合物，含有本发明第三方面所述的纯化 的猪圆环病毒以及药学上可接受的载体。
[0030] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0031] 图1显示了离子交换柱柱效测定图谱。
[0032] 图2显示了离子交换柱层析图谱，A峰为未被吸附的杂蛋白峰。B峰为以IM NaCl-20mM磷酸盐缓冲液洗脱收集的猪圆环病毒抗原蛋白峰。
[0033] 图3显示了凝胶色谱柱层析图谱，以0. OlM磷酸盐缓冲液洗脱收集的猪圆环病毒 抗原蛋白峰（箭头指出的峰）。
[0034] 图4显示了 Lowry法测定蛋白含量的标准曲线。
[0035] 图5显示了 15% SDS-PAGE电泳检测图。其中，图5A为考马斯亮蓝R-250染色； 图5B为银染。
[0036] 图 5A 中，泳道样品分别为（从左至右）：l-Marker(116KD、66. 2KD、45. 0KD、 35. 0KD、25. 0KD、18. 4KD、14. 4KD)、2_猪圆环病毒原样、3-离子交换柱层析洗脱液、4-凝胶 色谱柱层析洗脱液、5-分子筛柱层析峰2-1、6_分子筛柱层析峰2-2、7_原样浓缩后样品、 8-浓缩洗柱、9-离子交换柱层析清洗液。
[0037] 图5B中，泳道样品分别为（从左至右）：1-Marker、2-离子交换柱层析洗脱液、 3-猪圆环病毒原样、4-9样品同左图。
[0038] 图6显示了 ELISA定性检测结果。
[0039] 图7显示了分子筛柱层析图谱，其中箭头所指为各收集峰，含猪圆环病毒抗原的 蛋白峰为峰2。
【具体实施方式】
[0040] 本发明人经过广泛而深入的研究，通过对生产工艺的大量摸索，本发明人意料地 发现，基于特定的色谱层析介质，可极其有效地将猪圆环病毒与其他杂质分离开，从而对疫 苗进行高效精制纯化。由此，本发明提供一种免疫原性好、保护性强、毒副作用小的猪圆环 病毒疫苗。在此基础上完成本发明。
[0041] 如本文所用，术语"本发明层析介质"指可特异性地将猪圆环病毒与其他杂质有效 分离的离子交换树脂，尤其是Diamond X系列树脂。
[0042] 层析介质
[0043] 本发明人筛选了各种不同的分离方法及分离介质，发现，一类特定的离子交换树 月旨（包括Diamond X系列），与猪圆环病毒抗原的结合能力较其他介质更强，而该介质与绝 大多数的其他杂质（包括过敏原蛋白等）则几乎不结合；由于猪圆环病毒抗原在离子交换 柱上使用〇. 09-0. 12M NaCl盐洗柱，可去除大量杂蛋白，进一步当使用高浓度的洗脱盐时， 即0. 8-2. OMNaCl洗脱时，可获得相对较纯的猪圆环病毒抗原，这就实现了原液大量、快速、 有效纯化的目的。
[0044] 适用于本发明的离子交换树脂包括Diamond X系列或类似性状的树脂。这些树脂 可通过已知的方法制备或可通过市场购得。
[0045] 在本发明中，层析介质的用量没有特别限制，通常可根据待纯化的原料中所含的 猪圆环病毒数量而定。
[0046] 通常，IOOg或ml的层析介质可一次吸附（或分离）约500-1000mg的猪圆环病毒。 因此，对于细胞培养后获得的含猪圆环病毒的原料而言，通常对于约5L原料液而言，可用 约100-2000ml的层析介质，较佳地约200-1000ml。
[0047] 纯化方法
[0048] 本发明提供了一种基于本发明上述的特定层析介质对猪圆环病毒进行纯化的方 法，主要包括以下步骤：
[0049] (a)提供待纯化的原料，所述原料为含猪圆环病毒的液态样品；
[0050] (b)将所述液态样品上样于离子交换层析柱（作为第一层析柱），介质为Diamond X，使得猪圆环病毒抗原结合于所述的离子交换柱；
[0051] (C