一种h9亚型禽流感病毒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，涉及H9亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感灭活疫 苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 禽流感（Avian influenza，Al)是由A型流感病毒引起的一种严重危害禽类健康 的传染性疾病。禽类感染禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)后，症状可表现为非 显性感染、亚临诊感染，或轻度呼吸道疾病、产蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多种形 式。根据AIV对易感鸡致病性的差异，可将AIV分为高致病性AIV和低致病性AIV。
[0003] 1966年Hommee等从美国的Wisconsin北部患有温和呼吸道疾病的火鸡中分离到 了一株AIV-A/Turkey/Wisconsin/1/66,经血清学鉴定为H9亚型，这是H9亚型AIV的第一 个分离株。之后，H9N2AIV相继在世界其他地方被发现，并呈广泛流行的态势，给养禽业造成 严重的经济损失。法国的Bennejean在1979年和1980年，从鸡体内分离到能引起亚临床 症状的禽流感病毒H9N2,1978年和1979年在美国发病的火鸡中分离到H9N2AIV，Alexander 等报道，2009年Nagarajan等从印度某鸡场中也分离到了 H9N2AIV。1994-1999年由H9N2 AIV引起的AI爆发相继发生于世界各地，包括欧洲的爱尔兰、德国、意大利、亚洲的伊朗、巴 基斯坦、沙特阿拉伯、以色列、韩国、中国以及美国和南非等地。
[0004] H9N2 AIV在我国的流行情况。Shortridge (1992)早在1975年至1985年，就对香 港活禽市场的禽类进行了长期的流感监测，从外表健康的鸭体内分离到了 H9亚型AIVdS 是却没有在鸡体内发现这个亚型的AIV。1994年广东省某鸡场蛋鸡产蛋下降14%?75%， 肉鸡死亡率在10 %?40 %，陈伯伦等从临床病鸡体内分离到了 6株病毒，血清学鉴定为H9 亚型，这是我国内地首次分离到H9亚型AIV，将这些病毒实验室接种鸡，表现为典型的临床 症状，但是很快就康复了，并不致鸡死亡。1996年，唐秀英等从四川发病鸡群中分离到1株 H9N2病毒，陈福勇等也从华北地区分离到H9N2 AIV，并对其核蛋白的基因序列进行了克隆 和分析。近年又从我国部分地区的发病鸡群、鸭群、鹌鹑体中，分离到多株H9N2 AIV，通过对 我国部分省、市、区商品蛋鸡场及养鸡专业村进行禽流感血清学调查中发现，H9亚型阳性鸡 群占总的AIV抗体阳性鸡群的93. 67%，其中绝大部分是H9亚型，说明H9亚型AIV在我国 广泛存在，是我国现有AIV的主要亚型，对我国养禽业的发展造成了巨大的经济损失。
[0005] 由于禽流感病毒变异非常快，给禽流感防控带来困难。目前接种疫苗是防控禽流 感的主要手段之一，由于禽流感病毒变异快，流行毒株多，血清学多且无交叉免疫，其作用 大大受到限制。
[0006] 由此可见，本领域中需要免疫原性更强，交叉保护性更好的疫苗H9亚型禽流感病 毒毒株。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种具有更强免疫原性和更好交叉保护性的H9亚型禽流 感病毒，由其制备的H9亚型禽流感灭活疫苗及其制备方法。
[0008] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 在第一方面，本发明提供了一种H9亚型禽流感病毒，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏日期为2010年10月22日，保藏编号为CGMCC No.9813。
[0010] 在第二方面，本发明提供了一种H9亚型禽流感灭活疫苗，所述疫苗包括灭活的如 第一方面所述的H9亚型禽流感病毒。
[0011] 在第三方面，本发明提供了一种H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，包括以下步 骤：
[0012] (a)对包含第一方面所述的H9亚型禽流感病毒的培养液进行灭活，以便获得含有 灭活H9亚型禽流感病毒的溶液；
[0013] (b)向所述含有灭活H9亚型禽流感病毒的溶液加入乳化剂制备水相；以及
[0014] (c)将所述水相与油相进行混合乳化，以获得所述H9亚型禽流感灭活疫苗
[0015] 在本发明的H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法中，在步骤（a)之前，所述方法还 可以包括将如第一方面所述H9亚型禽流感病毒接种非免疫鸡胚中，并在35. 5?37. 5°C，优 选的36. 0?37. 0°C，更优选的36. 5 °C下进行培养，收集所获得的鸡胚尿囊液并通过连续流 离心收集上清以获得包含如第一方面所述H9亚型禽流感病毒的培养液，禽流感病毒液血 凝试验HA效价兰2 8 (1:256)，并且毒价ELD5c^ 10 8,可以使用。
[0016] 在本发明的H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法中，步骤（a)中所述的灭活可以包 括在2°C?8°C，优选的4°C -6°C条件下，利用终浓度为1:2000?I :4000，优选1:2500? 1 :3500,更优选1:3000的丙内酯对所述包含H9亚型禽流感病毒的培养液进行灭活处理 16?36小时，优选的20-30小时，更优选的25小时；并在37°C条件下水解2小时使丙内酯 发生水解，以便获得含有灭活H9亚型禽流感病毒的溶液。
[0017] 在本发明的H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法中，步骤（b)中所述的制备水相可 以包括将所述含有灭活H9亚型禽流感病毒的溶液与吐温-80按照94?97 :3?6的体积 比例进行混合，以得到水相；其中，所述吐温-80的浓度为3. 0%。
[0018] 在本发明的H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法中，所述油相的制备可以包括将 医用级白油（MARCAL-52,美孚）、司本-80以及硬脂酸铝按照94 :6 :2的质量比进行混合，以 得到所述油相。
[0019] 在本发明的H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法中，步骤（c)中将所述水相与油相 进行混合乳化可以包括将所述水相和油相按照体积比为2 :3?2 :4进行混合乳化，以获得 所述H9亚型病疫苗。
[0020] 在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的H9亚型禽流感病毒在预防和治疗 H9亚型禽流感的药物的制备中的应用。
[0021] 在第五方面，本发明提供了如第二方面所述的H9亚型禽流感灭活疫苗在预防和 治疗H9亚型禽流感的药物的制备中的应用。
[0022] 本发明的有益技术效果为：（具体见实施例4)
[0023] 1、与现有的H9亚型禽流感病毒相比，本发明的H9亚型禽流感病毒免疫原性更强 和交叉保护性更好。具体见实施例4.
[0024] 2、与现有的H9亚型禽流感病毒疫苗相比，本发明的H9亚型禽流感病毒疫苗具有