一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物细菌性病害防控技术领域，具体涉及一种烟草青枯菌噬菌体资源 的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 烟草青枯病是由革兰阴性细菌青枯雷尔氏菌（简称青 枯菌)引起，是危害烟草的主要病害之一。青枯菌分布广泛，种性复杂，宿主众多，遗传多样 性富丰，它能侵染50多个科中的200多种植物包括烤烟、马铃薯、西红柿、辣椒和香蕉等重 要的农作物。在烟叶生产中，尽管选择种植抗性烟草品种，采用化学药剂防治，改善土壤结 构以及合理轮作等综合措施加以防治，能够在一定程度上能减少烟草青枯病危害引起的损 失，但仍无法有效控制烟草青枯病的发生，因此人们期望发展更安全和有效的方法和策略 来防控青枯病。随着人们对环境安全和农产品安全要求的提高，随着抗生素的广泛使用以 及耐药性或抗药性的出现，采用生物防控的方法引起了人们的关注，噬菌体疗法作为传统 药物疗法的替代方法来防控细菌性病害被寄予厚望。噬菌体能在敏感宿主菌内快速增殖并 使之裂解，这一特性赋予噬菌体作为病害细菌的天然"杀手"的能力，也在生物防控利用中 具有应用潜力。因此建立快速有效的筛选青枯菌噬菌体资源的方法对于研究利用噬菌体防 控烟草青枯病的新策略和手段有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，该方法应用于从 植烟土壤、青枯病病土土壤和污水中筛选青枯菌噬菌体资源，为研究利用青枯菌噬菌体防 控烟草青枯病提供和收集青枯菌噬菌体资源。
[0004] 本发明的技术方案为：它采用以下步骤：第一，取土样及样品处理，经滤膜过滤得 滤液；第二，青枯菌株系培养获得青枯菌液；第三，将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌 液进行共培养；第四，噬菌体斑的挑选和保存；所用材料为无菌水、青枯菌株系、CPG培养 基、琼脂粉、低熔点琼脂，其中CPG培养基包括CPG固体培养基和CPG液体培养基。
[0005] 在第一步骤中，所述的取土样及样品处理是指取植烟地块中发生烟草青枯病的病 株和健康株之间的新鲜土壤，用〇. 5_的筛子过筛，去除土壤中的石块、植物根细和残体等 杂物；取过筛后的土壤小颗粒2. 0g，用5. Oml无菌水浸泡过夜，以8000r/min的转速离心 IOmin后，取上清液，用0. 22 μ m的滤膜过滤，取滤液备用。
[0006] 在第二步骤中，所述的青枯菌株系培养是指将青枯菌株系在CPG固体培养基上 28°C培养20-24h，用无菌接种环把青枯菌菌体收集到装有IOml无菌水的试管中，充分混 匀，用测定OD 6c?吸光值的方法控制青枯菌的浓度，把青枯菌浓度调节到I X 10 4cfu/ml备用。
[0007] 在第三步骤中，所述的将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养是 指，在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlCPG液体培养基，加入100 μ 1步骤一制备的过 滤液，然后加入300 μ 1步骤二制备的青枯菌液，在28°C震荡培养2-3h。取120 μ 1培养液， 均匀涂布于预先准备好的CPG固体培养基上；同时，取20ml培养液，在4°C以8000rpm的转 速离心IOmin后，取上清液，用0.22 μ m的滤膜过滤，取20 μ 1、10 μ 1、2 μ 1、0 μ 1分别与步 骤二制备的100 μ 1青枯菌液混匀，然后倒入事先灭菌好的浓度为〇. 7%[该百分比浓度指的 是0. 7% (m/v)]的3ml低熔点琼脂液中，混匀后倒入预先准备好的CPG固体培养基上。
[0008] 在第四步骤中，所述的噬菌体斑的挑选和保存是指，将步骤三制备好的共培养培 养皿，用保鲜膜或封口膜封好，在28°C培养箱中培养24-48h ;以步骤三中制备的0 μ 1加 步骤二制备的100 μ 1青枯菌液混匀的处理为对照，观察细菌斑，挑选单细菌斑，用灭过菌 的10 μ 1的枪头垂直接触目标噬菌斑,然后放入400 μ 1的无菌水中，室温或4°C冰箱中保 存1-2周；用灭过菌的10 μ 1的枪头垂直接触目标噬菌斑，然后放入甘油终浓度为20%的 400 μ 1无菌甘油水溶液中，-80°C冰箱中保存。
[0009] CPG固体培养基采用以下方法制作：水解酪蛋白：lg ;蛋白胨：10g ;葡萄糖：5g ;蒸 馏水：1000ml ;酸度调节到约pH7. 0,加入琼脂粉，使之终浓度为1. 5%(该百分比浓度为m/ V)的，在121°C下灭菌30min;冷却至55°C左右，分装到培养皿中备用；CPG液体培养基采用 以下方法制作：水解酪蛋白：lg ;蛋白胨：l〇g ;葡萄糖：5g ;蒸馈水：1000ml ;酸度调节到约 pH7. 0,在121°C下灭菌30min ;冷却至55°C左右，分装到培养皿中备用。一般保存1-3年。 [0010] 本发明的方法，需要的设备和资源简单，能快速有效的从土壤样品中分离到烟草 青枯菌噬菌体，便于大量的筛选青枯菌噬菌体资源，构建青枯菌噬菌体库，弥补现有青枯菌 噬菌体保存资源缺乏，克服现有技术中因培养、筛选噬菌体资源较慢，从而影响规模化、产 业化将菌体资源用于生物防控领域的不足。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明的植烟土壤样品取样点示意图(照片）； 图2为本发明的培养基上形成的噬菌斑示意图（照片）。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实例对本发明进一步详细的说明，但实例不是对本发明的限定。
[0013] 1 材料。
[0014] 无菌水、青枯菌株系、CPG培养基、琼脂粉、低熔点琼脂、直径9cm的培养皿、控温培 养箱、保鲜膜、吸水纸、接种坏、移液器、分光光度计、手术刀、酒精灯、打火机、超净工作台、 高压灭菌锅等。青枯菌株系来源和宿主信息参见表1。
[0015] 2本发明的实施步骤如下： 第一，取土样及样品处理。植烟土壤从贵州省烟草科学研究院的福泉基地采获，取发 生烟草青枯病的植烟土壤(病株于健康株之间）2. Og (见图1)，用IOml浸泡，离心取上清 液，用0. 22 μ m的滤膜过滤法获得滤液，备用。0. 22 μ m的滤膜过滤购自波尔公司（PALL corporation)。
[0016] 表1青枯菌的来源与宿主信息
【主权项】
1. 一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：它采用以下步骤：第一，取土 样及样品处理，经滤膜过滤得滤液；第二，青枯菌株系培养获得青枯菌液；第三，将步骤一 中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养；第四，噬菌体斑的挑选和保存；所用材料为 无菌水、青枯菌株系、CPG培养基、琼脂粉、低熔点琼脂，其中CPG培养基包括CPG固体培养 基和CPG液体培养基。
2. 根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：在第一步 骤中，所述的取土样及样品处理是指取植烟地块中发生烟草青枯病的病株和健康株之间的 新鲜土壤，用〇. 5_的筛子过筛，去除土壤中的石块、植物根细和残体等杂物；取过筛后的 土壤小颗粒2. Og,用5. Oml无菌水浸泡过夜，以8000r/min的转速离心IOmin后，取上清液， 用0. 22 μ m的滤膜过滤，取滤液备用。
3. 根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：在第二步 骤中，所述的青枯菌株系培养是指将青枯菌株系在CPG固体培养基上28°C培养20-24h，用 无菌接种环把青枯菌菌体收集到装有IOml无菌水的试管中，充分混匀，用测定〇D_吸光值 的得方法控制青枯菌的浓度，把青枯菌浓度调节到lX10 4cfu/ml备用。
4. 根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：在第三步 骤中，所述的将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养是指，在灭菌后的500ml 三角瓶中，加入300mlCPG液体培养基，加入100 μ 1步骤一制备的过滤液，然后加入300 μ 1 步骤二制备的青枯菌液，在28°C震荡培养2-3h ;取120 μ 1培养液，均匀涂布于预先准备好 的CPG固体培养基上；同时，取20ml培养液，在4°C以8000rpm的转速离心IOmin后，取上 清液，用〇. 22μπ?的滤膜过滤，取20μ 1、1〇μ 1、2μ 1、〇μ 1分别与步骤二制备的100μ 1青 枯菌液混匀，然后倒入事先灭菌好的浓度为0. 7%的3ml低熔点琼脂液中，混匀后倒入预先 准备好的CPG固体培养基上。
5. 根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：在第四步 骤中，所述的噬菌体斑的挑选和保存是指，将步骤三制备好的共培养培养皿，用保鲜膜或封 口膜封好，在28°C培养箱中培养24-48h ;以步骤三中制备的0 μ 1加步骤二制备的100 μ 1 青枯菌液混匀的处理为对照，观察细菌斑，挑选单细菌斑，用灭过菌的10 μ 1的枪头垂直接 触目标噬菌斑，然后放入400 μ 1的无菌水中，室温或4°C冰箱中保存1-2周；用灭过菌的 10 μ 1的枪头垂直接触目标噬菌斑，然后放入甘油终浓度为20%的400 μ 1无菌甘油水溶液 中，-80°C冰箱中保存。
6. 根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：CPG固体 培养基采用以下方法制作：水解酪蛋白：lg ;蛋白胨：l〇g ;葡萄糖：5g ;蒸馈水：1000ml ;酸 度调节到约PH7. 0,加入琼脂粉，使之终浓度为1. 5%，在121°C下灭菌30min ;冷却至55°C 左右，分装到培养皿中备用；CPG液体培养基采用以下方法制作：水解酪蛋白：lg ;蛋白胨： l〇g;葡萄糖：5g;蒸馏水：1000ml ;酸度调节到约pH7.0,在121°C下灭菌30min ;冷却至 55 °C左右，分装到培养皿中备用。
【专利摘要】本发明公开了一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，它采用以下步骤：第一，取土样及样品处理，经滤膜过滤得滤液；第二，青枯菌株系培养获得青枯菌液；第三，将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养；第四，噬菌体斑的挑选和保存；所用材料为无菌水、青枯菌株系、CPG培养基、琼脂粉、低熔点琼脂，其中CPG培养基包括CPG固体培养基和CPG液体培养基。该方法可以应用于从植烟土壤、青枯病病土土壤和污水中筛选青枯菌噬菌体资源，为研究利用青枯菌噬菌体防控烟草青枯病提供和收集青枯菌噬菌体资源。
【IPC分类】C12R1-92, A01P1-00, C12N7-00
【公开号】CN104560891
【申请号】CN201510008306
【发明人】蔡刘体, 陆宁, 石俊雄
【申请人】贵州省烟草科学研究院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月8日