一种肝癌重组细胞系及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝癌重组细胞系及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肝癌即肝脏恶性肿瘤，是外科疾病中的常见病和多发病，肝脏恶性肿瘤可分为原 发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发 性肝癌，是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少 见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、 胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。
[0003] 由于肝脏是人体最大的实质性器官，承担人体的各类重要代谢功能，因此，肝脏一 旦出现恶性肿瘤将导致未及生命的严重后果。又由于肝脏具有丰富的血流供应，与人体的 重要结构如下腔静脉、门静脉、胆道系统等关系密切；肝脏恶性肿瘤发病隐匿，侵袭性生长 快速，其治疗甚为困难。
[0004] 本领域的广大研宄人员，进行了大量的试验研宄，通过对肝癌细胞进行实验研宄， 进而探宄肝癌的发病机制及相应的治疗方案，但是在实验的过程中经常使用一些经过重组 的稳定肝癌细胞系，这些细胞重新构建的步骤繁琐，造成时间上的浪费，且用其他方法，如 小干扰RNA的方法得到的细胞维持蛋白敲减的效果一般为一周作用，不能长期稳定的存 在。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种肝癌重组细胞系及其制备 方法，本发明的肝癌重组细胞系能够达到稳定敲减蛋白的效果，并且能够极大的节省构建 时间。
[0006] 本发明所采用的技术方案为：
[0007] -种肝癌重组细胞系，所述肝癌重组细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No. 10093。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏日期：2014年11月25日，分类命名：人源的肝癌细胞系。
[0008] 制备上述一种肝癌重组细胞系的方法，其包括以下步骤：
[0009] 1)将ImL浓度为L 3-1. 5 X IO6Cells/mL的293T细胞铺于IOcm的培养皿中，在培 养皿中加入IOmL包含10%热失活胎牛血清的DMEM培养液，将培养皿放于37°C培养箱中， 在5% 0)2的条件下培养至细胞汇合度为70-80%，即可包装病毒；
[0010] 2)分别在第一离心管和第二离心管中加入200uL Opti-MEM培养液；在第一离心 管中加入2. 5ug ORF/shRNA/miRNA表达质粒及5uL的慢病毒包装质粒复合物；在第二离心 管中加入15ul转染试剂Endofectin ;将第二离心管中的液体逐滴滴加到第一离心管中后， 将第一离心管在室温下孵育l〇_25min，至第一离心管内形成DNA/EndoFctin复合物；
[0011] 3)将步骤2)中的DNA/EndoFctin复合物加入到步骤1)中的包装细胞中，混匀后 在培养箱中放置8-14h ;弃掉包含10%热失活胎牛血清的DMEM培养基，更换为含有2-5% 热失活的胎牛血清和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，并加入1/500的滴度增强剂后，继续 放入培养箱中培养48h，收集含有病毒的培养液；
[0012] 4)将含有病毒的培养液在4°C、离心力为500g的条件下离心IOmin后弃沉淀，将 上清液过0. 45um的滤膜，即得病毒液；将病毒液转染细胞或者放于-80°C冰箱保存；
[0013] 5)阳性组：将MHCC97H靶细胞铺于六孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，更换2-5% 热失活的胎牛血清和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，加入ImL病毒液和ImL浓度为 5-8ug/mL的Polybrene，将六孔板先放于4°C冰箱2h以增加转染效率，再继续放入培养箱 中培养24h后，更换含10% FBS和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，继续在培养箱中培养 48h ；
[0014] 阴性对照组：不加病毒液，其余与阳性组相同；
[0015] 将步骤5)中培养48h后的细胞从六孔细胞培养板中转出，分别将阳性组和阴性对 照组的更换含有浓度为2-5ug/mL嘌呤霉素的DMEM培养液进行筛选，培养液更换频率为每 天更换一次，筛选两周至阴性对照组（未转染病毒）全部死亡即可。
[0016] 优选地，步骤2)中所述ORF/shRNA/miRNA表达质粒的基因序列中第280-298位为 SEQ ID No. 1〇
[0017] 优选地，步骤2)中所述ORF/shRNA/miRNA表达质粒的基因序列中第250-278位为 SEQ ID No. 2〇
[0018] 本发明的有益效果为：本发明利用慢病毒包装的方法，将质粒和转染试剂共转染 293T细胞，产生慢病毒颗粒，再将产生的慢病毒加入到靶细胞中，随机插入到靶细胞的基因 中，进而达到稳定敲减蛋白A的效果。肝癌细胞系建立了稳定敲减蛋白A的细胞系，并且得 到了明显的结果。避免了实验者在试验中重新构建的繁琐步骤，极大的节省了时间。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明一种肝癌重组细胞系实施例3或4中阴性对照组获得的细胞系的倒 置荧光显微镜图；
[0020] 图2是本发明一种肝癌重组细胞系实施例3中获得的细胞系的倒置荧光显微镜 图；
[0021] 图3是本发明一种肝癌重组细胞系实施例4中获得的细胞系的倒置荧光显微镜 图；
[0022] 图4是本发明一种肝癌重组细胞系的Real time PCR结果分析图；
[0023] 图5是本发明一种肝癌重组细胞系的western blot图。
【具体实施方式】
[0024] 本发明提供了一种肝癌重组细胞系，所述肝癌重组细胞系保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No. 10093。地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月25日，分类命名：人源的肝癌细胞系。
[0025] 实施例1
[0026] 制备上述一种肝癌重组细胞系的方法，其包括以下步骤：
[0027] 1)将ImL浓度为1.3X106cells/mL的293T细胞铺于IOcm的培养皿中，在培养皿 中加入IOmL包含10 %热失活胎牛血清的DMEM培养液，将培养皿放于37°C培养箱中，在5 % 〇)2的条件下培养至细胞汇合度为70-80%，即可包装病毒；
[0028] 2)分别在第一离心管和第二离心管中加入200uL Opti-MEM培养液；在第一离心 管中加入2. 5ug ORF/shRNA/miRNA表达质粒及5uL的慢病毒包装质粒复合物；在第二离心 管中加入15ul转染试剂Endofectin ;将第二离心管中的液体逐滴滴加到第一离心管中后， 将第一离心管在室温下孵育l〇min，至第一离心管内形成DNA/EndoFctin复合物；其中，所 述ORF/shRNA/miRNA表达质粒的基因序列中第280-298位为SEQ ID No. 1。
[0029] 3)将步骤2)中的DNA/EndoFctin复合物加入到步骤1)中的包装细胞中，混匀后 在培养箱中放置8h ;弃掉包含10%热失活胎牛血清的DMEM培养基，更换为含有2%热失活 的胎牛血清和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，并加入1/500的滴度增强剂后，继续放入培 养箱中培养48h，得到含有病毒的培养液；
[0030] 4)将含有病毒的培养液在4°C离心力为500g的条件下离心IOmin后弃沉淀，将上 清液过0. 45um的滤膜，即得病毒液；将病毒液转染细胞或者放于-80°C冰箱保存；
[0031] 5)阳性组：将靶细胞MHCC97H铺于六孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，更换2%热 失活的胎牛血清和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，加入ImL病毒液和ImL浓度为8ug/ mL的Polybrene，将六孔板先放于4°C冰箱2h以增加转染效率，再继续放入培养箱中培养 24h后，更换含10% FBS和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，继续在培养箱中培养48h ;
[0032] 阴性对照组：不加病毒液，其余与阳性组相同；
[0033] 6)将步骤5)中培养48h后的细胞从六孔细胞培养板中转出，分别将阳性组和阴性 对照组的更换含有浓度为4ug/mL嘌呤霉素的DMEM培养液进行筛选，培养液更换频率为每 天更换一次，筛选两周至阴性对照组未转染病毒全部死亡即可。
[0034] 实施例2
[0035] 制备上述一种肝癌重组细胞系的方法，其包括以下步骤：
[0036] 1)将ImL浓度为1.4X106cells/mL的293T细胞铺于IOcm的培养皿中，在培养皿 中加入IOmL包含10 %热失活胎牛血清的DMEM培养液，将培养皿放于37°C培养箱中，在5 % 〇)2的条件下培养至细胞汇合度为70-80%，即可包装病毒；
[0037] 2)分别在第一离心管和第二离心管中加入200uL Opti-MEM培养液；在第一离心 管中加入2. 5ug ORF/shRNA/miRNA表达质粒及5uL的慢病毒包装质粒复合物；在第二离心 管中加入15ul转染试剂Endofectin ;将第二离心管中的液体逐滴滴加到第一离心管中后， 将第一离心管在室温下孵育20min，至第一离心管内形成DNA/EndoFc