2O 补足到 I Ομ?
[0083] 将逆转录反应中的混合物，加到步骤1)去除基因组DNA的反应液中，充分混匀。在 42°C的条件下孵育15min或在95°C的条件下孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA，可用于 后续试验或低温保存。
[0084] 3、real time PCR 引物获得：
[0085] 1)通过检索，从Pubmed上获取，并通过Primer Blast分析，结果显示能够扩增出 目的片段；
[0086] 2)扩增效率一致性的确认
[0087] 利用Λ ACt法进行相对定量的前提是目的基因和内参基因（β-actin)的扩增效 率一致。将cDNA样品进行稀释（10倍），得到的cDNA稀释液用于Real time PCR的检测。 然后以稀释的样品为模板，按如下体系加样：
[0088] 2XSuperReal Premix Plus C with SYBR Green I) \Q\\L Forward primer 0.6 μ? Reverse primer 0.6 μι cDNA + ddH20 8 4μ? 5()xROX Dye 0AμL
[0089] 冰上加样后，短暂离心收集溶液到管底，在real time PCR仪上按照试剂盒推荐条 件进行real time PCR，确认各目的基因相对于内参基因的表达水平。
[0090] 从图1中可以看出由于转染的目的质粒带有荧光标签，所以在倒置的荧光显微镜 下观察，细胞均带有荧光。
[0091] 从图2中可以看出在mRNA水平sh-3TXN得到了明显的敲减效果。
[0092] (二）在蛋白水平验证，将筛选完成的细胞提蛋白，用Western blot检测目的蛋白 的表达情况
[0093] 1、收集蛋白样品
[0094] 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞，收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上 样量一致，需要用BCA试剂盒测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
[0095] 2、电泳
[0096] (I) SDS-PAGE凝胶配制，在收集的蛋白样品中加入适量5X的SDS-PAGE蛋白上样缓 冲液。100°C或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
[0097] (2)上样与电泳
[0098] 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
[0099] 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，使用预染蛋白质 分子量标准Marker。在上层胶时使用低电压80V，恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用 高电压120V恒压电泳。电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预 染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
[0100] 3、转膜（Transfer)
[0101] 本发明中选用PVDF膜。使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为 250mA，转膜时间为3h。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越 大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
[0102] 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把 转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通 常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行 染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶 进行染色，以观察蛋白的残留情况。
[0103] 4、封闭
[0104] 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分 钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥， 否则极易产生较高的背景。加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。 对于一些背景较高的抗体，可以在4°C封闭过夜。
[0105] 5、一抗孵育
[0106] 参考一抗的说明书，按照适当比例用Western -抗稀释液稀释一抗。
[0107] 立即加入稀释好的一抗，在4°C缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤 液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。 共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
[0108] 6、二抗孵育
[0109] 参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶 (HRP)标记的二抗。立即加入稀释好的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收 二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加 入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加 洗涤次数。
[0110] 7、蛋白检测
[0111] 使用BeyoECL，Western荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。使用G-Box仪器 进行曝光检测。
[0112] 从图3中，可以看出sh-3TXN和sh-4TXN两个细胞系中的硫氧还蛋白TXN含量明 显低于对照组。
[0113] 本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种 形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技 术方案，均落在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种肝癌重组细胞系，其特征在于：所述肝癌重组细胞系保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No. 10093。
2. 制备权利要求1所述的一种肝癌重组细胞系的方法，其特征在于：其包括以下步 骤： 1) 将ImL浓度为1. 3-1. 5 X 106cells/mL的293T细胞铺于IOcm的培养皿中，在培养皿 中加入IOmL包含10 %热失活胎牛血清的DMEM培养液，将培养皿放于37°C培养箱中，在5 % 〇)2的条件下培养至细胞汇合度为70-80%，即可包装病毒； 2) 分别在第一离心管和第二离心管中加入200uL Opti-MEM培养液；在第一离心管中 加入2. 5ug ORF/shRNA/miRNA表达质粒及5uL的慢病毒包装质粒复合物；在第二离心管中 加入15ul转染试剂Endofectin ;将第二离心管中的液体逐滴滴加到第一离心管中后，将第 一离心管在室温下孵育l〇_25min，至第一离心管内形成DNA/EndoFctin复合物； 3) 将步骤2)中的DNA/EndoFctin复合物加入到步骤1)中的包装细胞中，混匀后在培 养箱中放置8-14h ;弃掉包含10%热失活胎牛血清的DMEM培养基，更换为含有2-5%热失 活的胎牛血清和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，并加入1/500的滴度增强剂后，继续放入 培养箱中培养48h，收集含有病毒的培养液； 4) 将含有病毒的培养液在4°C、离心力为500g的条件下离心IOmin后弃沉淀，将上清 液过0. 45um的滤膜，即得病毒液；将病毒液转染细胞或者放于-80°C冰箱保存； 5) 阳性组：将MHCC97H靶细胞铺于六孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，更换2-5%热失 活的胎牛血清和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，加入ImL病毒液和ImL浓度为5-8ug/mL 的Polybrene，将六孔板先放于4°C冰箱2h以增加转染效率，再继续放入培养箱中培养24h 后，更换含10% FBS和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基，继续在培养箱中培养48h ; 阴性对照组：不加病毒液，其余与阳性组相同； 6) 将步骤5)中培养48h后的细胞从六孔细胞培养板中转出，分别将阳性组和阴性对照 组的更换含有浓度为2-4ug/mL嘌呤霉素的DMHM培养液进行筛选，培养液更换频率为每天 更换一次，筛选两周至阴性对照组全部死亡即可。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述ORF/shRNA/miRNA表达质 粒的基因序列中第280-298位为SEQ ID No. 1。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述ORF/shRNA/miRNA表达质 粒的基因序列中第250-278位为SEQ ID No. 2。
【专利摘要】本发明涉及一种肝癌重组细胞系及其制备方法。其中所述肝癌重组细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC？No.10093。本发明的有益效果为：本发明利用慢病毒转染的方法，将质粒和转染试剂共转染293T细胞，产生病毒颗粒，再将产生的病毒加入到靶细胞中，随机插入到靶细胞的基因中，进而达到稳定过表达或者敲减蛋白A的效果。我们建立了稳定敲减蛋白A的肝癌细胞系，并且得到了明显的结果。避免了实验者在试验中重新构建的繁琐步骤，极大的节省了时间。CGMCC No．1009320141125
【IPC分类】C12N5-10, C12N15-867, C12R1-91
【公开号】CN104560881
【申请号】CN201410842974
【发明人】曹曼卿, 张倜
【申请人】曹曼卿, 张倜
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月31日