一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法及应用，属于细胞 生物学和神经生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 神经元的分离培养，是研宄神经元生长因子、轴突向外生长、分化以及感觉生理学 等的常用技术。尽管分离胚胎或新生动物神经细胞形成突触之前的神经元要相对容易一 些，但胚胎神经元与成熟神经元在电生理学、发育、再生等方面有着不同的特性。因此对成 熟神经细胞的培养在很多研宄中是非常必要的。但在神经元原代培养过程中一直存在着细 胞产量和质量都不高的问题。
[0003] 目前，现有的三叉神经细胞原代培养技术多为胶原酶消化法，其在培养过程中，有 些细节考虑不够全面，如：在没有〇)2平衡调节装置时培养液的稳定性不好，处理过程对组 织或细胞的影响较大，对细胞损伤较大，消化不够彻底，杂质细胞较多，培养所得细胞不纯 等问题，因此细胞的产量和质量都不高。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离 培养方法及应用，采用的技术方案如下：
[0005] 本发明的目的在于提供一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法，该方 法是将哺乳动物三叉神经组织置于含有L-15培养液的培养皿上进行清洗处理，剪碎后依 次用十一型胶原酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA进行消化处理，细胞筛过滤后对滤液进行 密度梯度离心，悬浮后接种于包被好的细胞培养装置内，用基础神经培养基进行培养。
[0006] 所述方法步骤如下：
[0007] 1)将所得的哺乳动物三叉神经组织置于含L-15培养液的培养皿上清洗后剪碎， 获得预处理三叉神经组织；
[0008] 2)将步骤1)所得预处理三叉神经组织依次用十一型胶原酶、胰蛋白酶和胰蛋白 酶-EDTA进行消化处理，经过中和、离心和悬浮后用细胞筛过滤去除组织碎片，获得细胞悬 浮液；
[0009] 3)步骤2)所得细胞悬浮液，对滤液进行密度梯度离心，去除细胞碎片和杂细胞， 获得纯化细胞；
[0010] 4)将步骤3)所得纯化细胞用基础神经培养基悬浮，然后接种到已经包被好的细 胞培养装置内，在培养箱中用基础神经培养基进行培养，培养24-48h获得三叉神经节细 胞。
[0011] 步骤1)所述哺乳动物为除胚胎期和新生期以外的哺乳动物。
[0012] 优选地，步骤1)所述哺乳动物为8-12周龄的大鼠。
[0013] 步骤2)所述消化处理过程为：（1)将步骤1)所得的预处理三叉神经组织用5mL 经L-15培养液稀释的200U i^一型胶原酶于37°C下消化90分钟，消化时每10-15分钟摇动 一次，使胶原酶能够充分而均匀地消化组织；（2)向混合物中加入500 μ L的浓度为0. 25% 的胰蛋白酶，37°C水浴中继续消化20分钟，离心后收集消化的组织和细胞；（3)加入5mL经 L-15培养液稀释的胰蛋白酶-EDTA，摇匀后于37°C水浴继续消化20分钟；（4)加入IOmL含 10%胎牛血清的神经培养基，中和消化酶，离心得到沉淀细胞；（5)加入200 μ L含2% B27 的神经培养基，悬浮细胞，再用200 μ m孔径的细胞筛过滤细胞悬液，用2mL的含2 % Β27神 经培养基进行冲洗细胞筛，获得细胞悬浮液。
[0014] 步骤3)所述密度梯度离心为Optipr印密度梯度离心，过程为：将OPTI和Nb+B27 培养液依次按照173:827,124 :876,99:901，74:926的体积比进行混合，得到四个密度梯度 液，按顺序依次将其缓慢加至15mL的离心管内，然后将2mL细胞悬浮液缓慢加到密度梯度 液的上面，800g离心15min，弃掉上两层液体，收集剩余液体。
[0015] 步骤4)所述包被培养装置是在培养的前一天，向培养装置内加入无菌多聚赖氨 酸溶液，包被30分钟，吸出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜晾干备用。
[0016] 步骤4)所述悬浮是加入IOmL基础神经培养基，IOOOrpm离心5min，收集细胞后用 100 μ L神经培养液悬浮；
[0017] 所述培养的条件为37°C、5% CO2及饱和湿度。
[0018] 所述方法具体步骤为：
[0019] 1)取出大鼠的三叉神经，置于含L-15培养液的培养皿上，然后进行清洗处理，去 除黏附的其他组织，用眼科剪或手术刀将其剪碎，获得预处理三叉神经组织；
[0020] 2)将步骤1)所得预处理三叉神经组织用5mL经L-15培养液稀释后得到的200U 十一型胶原酶在37°C下消化90分钟，消化时每10-15分钟摇动一次，使胶原酶能够充分而 均匀地消化组织；
[0021] 3)向步骤2)所得混合物中加入500 μ L浓度为0. 25%的胰蛋白酶，37°C水浴中继 续消化20分钟，离心，收集消化的组织和细胞，倒掉上清液；
[0022] 4)向步骤3)所得组织和细胞中加入5mL经L-15培养液稀释后得到的胰蛋白 酶-EDTA，摇匀后37°C水浴继续消化20分钟，加入IOmL含10%胎牛血清的神经培养基，中 和消化酶，离心得到沉淀细胞，弃掉上清液；
[0023] 5)向步骤4)所得沉淀细胞中加入200 μ L含2% B27的神经培养基，悬浮细胞；
[0024] 6)用200 μ m孔径的细胞筛过滤步骤5)所得悬液，用2mL的含2 % Β27基础神经 培养基冲洗细胞筛，获得细胞悬浮液；
[0025] 7)将 OPTI 和 Nb+B27 培养液依次按照 173:827,124:876,99:901，74:926 的体积比 进行混合，得到四个密度梯度液，按顺序依次将各梯度液缓慢加至15mL的离心管内，然后 将2mL细胞悬浮液缓慢加到密度梯度液的上面，800g离心15min，弃掉上两层液体，收集剩 余液体；
[0026] 8)向步骤7)所得液体中加入IOmL基础神经培养基，IOOOrpm离心5min，收集细 胞，用100 μ L神经培养液悬浮；
[0027] 9)将步骤8)所得悬浮液均匀地接种到步骤9)所得的已包被的细胞培养装置内， 在培养箱中用基础神经培养基于37°C，5% CO2，饱和湿度的条件下培养24-48h后获得三叉 神经节细胞；
[0028] 所述已包被的细胞培养基装置，是在培养的前一天向培养装置内加入无菌多聚赖 氨酸溶液，包被处理30分钟，洗出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜晾干备用。本发 明所述方法适用于哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养。本发明有益效果：
[0029] 1.本发明优化了组织的消化方法，取缔了原有的蛋白酶消化过程，采用胶原酶和 胰蛋白酶联合消化，其消化过程和消化时间可使组织消化比较彻底，同时不使用吹吸的方 式来进一步分散细胞，对细胞的损伤大大减小。
[0030] 2.本发明在对组织体外清洗、消化以及分离细胞的过程中使用了 L-15培养基，能 够保证没有CO2平衡调节装置的条件下培养液的稳定性，提供了一个即使无 CO 2平衡调节， 也能保证稳定、对细胞或组织损伤很小的液体环境，稳定了渗透压、PH值等外部培养条件， 大大减小了处理过程中对组织或细胞的影响。
[0031] 3.现有培养技术多没有取出杂质的过程，本发明首先对消化后组织进行过滤，去 除大块杂质，再利用密度梯度离心的方法富集细胞，去除了消化过程中产生的大量的细胞 碎片以及其他细胞类型等杂质的干扰，使培养所得细胞更纯，细胞培养的成功率更高。
[0032] 4.利用本发明培养方法可以获得百万个左右较纯的三叉神经细胞，提高了细胞产 量和质量，解决了现有技术的不足，可以满足药理学、电生理学、发育、再生以及神经毒理学 等各方面的研宄。
【附图说明】
[0033] 图1三叉神经细胞相差显微镜图。
[0034] 图2三叉神经细胞荧光相差显微镜图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0036] 实施例I :SD大鼠三叉神经细胞分离培养
[0037] 1.包被培养板（皿）
[0038] 在培养的前一天，向要用的培养板（皿）内加入适量的（盖住皿底即可）市售的 无菌的多聚赖氨酸溶液，包被30分钟左右，吸出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜 晾干，备用。
[0039] 2.分离三叉神经组织的细胞
[0040] 将试验用的150-250g的SD大鼠的双侧三叉神经取出，置于含冷的Hank, s平衡盐 溶液中，进行清洗处理，去除粘附的其他组织，用眼科剪或手术刀将其剪碎，获得预处理三 叉神经组织。
[0041] 首先，用含1.5g/L XI-s胶原酶的