昆明犬精子体外获能及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物生殖生物学技术领域，具体是昆明犬精子体外获能及检测方法。
【背景技术】
[0002] 人及哺乳动物精子在刚射出或从附睾尾部取出时虽然具有运动能力，但还不能立 刻和卵细胞结合，需要在雌性生殖道中停留一段时间，发生一系列生理生化变化才具备使 卵细胞受精的能力，这种现象称为"精子获能"。当获能的精子进入卵丘细胞或与卵子透明 带结合时被激活，精子头部前端顶体破裂，发生所谓的"顶体反应"，顶体内所含的顶体酶被 释放出来，支持精子穿过透明带，从而导致精卵融合，完成受精。大量研究表明，精子获能是 所有哺乳动物精子受精前必须经历的一个生理阶段。
[0003] 早期的精子获能研究，采用体内获能的方法，即从交配后的雌性动物生殖道内取 出精子用于受精，借以分析获能的部位、时程及其机制。但这种对体内获能的研究常常受到 许多条件的限制，例如，精子在体内总是与雌性生殖道分泌物接触，而雌性生殖道中存在着 影响获能的因子，人们很难控制这种复杂的体内环境，因而给研究精子获能带来极大的困 难。
[0004] 为此，体外获能的研究方法应运而生。早期研究精子体外获能通常使用各种动物 的体液（如输卵管液、滤泡液和血清），而这些体液的成分相对复杂，很难确定何种成分参 与诱发或支持精子获能。自从Toyoda和Chang最先报道了采用一种特定的化学培养液成 功实现体外受精以来，研究精子体外获能已变得相对容易。现在，体外获能技术可以精确地 控制实验条件，逐个分析获能及其相关因子，由体外获能的研究结果可以揭示体内获能的 本质。最使人类受益的是，体外获能的成功直接导致了目前广泛应用于不育症治疗的试管 婴儿技术的诞生。
[0005] 虽然大部分动物精子的体外获能已再无技术障碍，但是获能的分子机理仍有许多 问题尚未阐明。目前，小鼠、仓鼠、牛、犬、羊、猪等动物以及人精子被用于进行获能分子机理 的研究。
[0006] 昆明犬是中国唯一列入世界知名警犬的优良定型犬种，是中国独立自主培育的唯 一工作犬种，在追踪、鉴别、搜毒、搜爆、巡逻、守候、警戒、消防、探雷等领域发挥着重要作 用，其种质资源极为宝贵，开展其精子获能的研究有利于该动物体外受精及人工繁殖技术 的发展，但关于昆明犬精子获能的研究目前未见报道，即使是其他犬种的精子获能，也仅见 于国外早期一些零星、不系统的报道，未明确犬精子获能的基本条件。本发明阐明了昆明犬 精子体外获能的必需条件，成功建立了该犬种精子的体外获能体系，丰富了动物精子获能 的内容，为深入研究昆明犬精子获能的分子机理奠定了良好基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是建立一种昆明犬精子体外获能及检测方法，为深入研究昆明犬精 子获能的分子机理奠定坚实基础。
[0008] 本发明所采取的技术方案如下： 昆明犬精子体外获能及检测方法，通过以下步骤实现： (1) 洗精液mCCM (W)及获能液mCCM的配制 按每IOOml溶液中含氯化钠0. 488g、氯化钾0. 0356g、磷酸二氢钾0. 0162g、丙酮酸钠 0. 0028g、乳酸钠60%水溶液0. 338ml、葡萄糖0. 05g、青霉素 G钠盐10000 IU、硫酸链霉素 0. 005g、酚红0. 002g的配方用Mi 11 i-Q超纯水配制洗精液mCCM (W)，经孔径0. 22 μ m滤器过 滤后将其于38°C水浴保温； 按每IOOml溶液中含氯化钠0. 488g、氯化钾0. 0356g、氯化钙0. 0222g、磷酸二氢钾 0. 0162g、碳酸氢钠0. 3159g、丙酮酸钠0. 0028g、乳酸钠60%水溶液0. 338ml、葡萄糖0. 05g、 牛血清白蛋白0. 3g、青霉素 G钠盐10000 IU、硫酸链霉素0. 005g、酚红0. 002g的配方用 Milli-Q超纯水配制获能液mCCM，经孔径0. 22 μ m滤器过滤后将其置于CO2培养箱38°C平 衡至少2小时； (2) 精液洗涤 将采集的新鲜精液15ml转至灭菌离心管中，加入IOml mCCM(W)洗精液，700g离心 5min，弃上清，再加 IOml mCCM(W)洗精液，700g离心5min洗涤一次，沉淀用适量mCCM(W)洗 精液重悬，使精子浓度为60 X IO6AiL ; (3) 体外获能 将上述洗涤后的精液分至2mL圆底离心管中，每管300 μ L ;每管再加入38°C预热平衡 的含2X (CaCl2、NaHCOjP BSA)的mCCM 300 μ L，将离心管置CO 2培养箱于38°C培养3小 时； (4) CTC获能检测 ① 、CTC染液配制：称取CTC 2mg，氯化钠38mg，半胱氨酸3mg，Tris缓冲液12mg， 加入 5mL Milli-Q 超纯水，用 IN NaOH 或 IN HCl 调 pH 为 7. 8 ; ② 、染色：避光条件下，在38°C预热的载玻片上加入10 μ L的CTC染液，再加10 μ L的 步骤（2)所得的精子悬液，10秒钟后加入2 μ L 12. 5%戊二醛Tris溶液，轻轻盖上盖玻片， 放于湿盒内，4°C避光过夜；取出载玻片，在紫外光下观察，记数，每组总数不少于200个，染 色精子分为三种类型： "F"型，为未获能精子，整个精子头部呈较亮的黄绿色； "B"型，为获能但未发生顶体反应的精子，精子的头部顶体区呈黄绿色，而顶体 后区较暗； "AR"型，为已发生顶体反应的精子，精子头部后区呈黄绿色，而顶体区变暗； (5) FITC-PSA检测诱发顶体反应 ① 、向步骤（3)获能3h的精子中加入钙离子载体A23187使其终浓度为10 μ M，于CO2 培养箱38°C继续培养30min ; ② 、取出孵育的精子50 μ L，加入ImL Tris缓冲液，700g离心5min，弃上清； ③ 、沉淀用4°C预冷的ImL无水甲醇于4°C固定30s ; ④ 、700g离心5min,弃上清，加入ImL Tris缓冲液，700g离心5min ; ⑤ 、加入FITC-PSA，使染料浓度为0· 05mg/mL，避光孵育20min ; ⑥ 、用PBS洗涤一次，吸取10 μ L于载玻片上，用荧光显微镜观察，计数，每组总数不少 于200个；染色精子分为两种类型： 顶体完整型：精子顶体区呈绿色，顶体后区变暗； 顶体丢失型：精子顶体区和顶体后区无荧光，精子中段有一绿色荧光带。<