一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物病毒技术领域，具体涉及一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方 法。
【背景技术】
[0002] 鸭黄病毒（鸭坦布苏病毒）是一种可以导致蛋鸭产蛋机能严重下降的病毒，其临 床表现为产蛋率突然下降，产蛋高峰期缩短，严重的在短时间内产蛋率可降为零，采食量也 会同时下降，个别有死亡现象。病理剖解可见卵巢充血、肿胀、坏死和萎缩等严重病变。该 病自从2010年首次在国内被发现后，已经造成山东、湖南、广东等蛋鸭养殖大省蛋鸭大面 积减产。目前，许多研宄机构在临床分离到了鸭黄病毒，并在体外进行了细胞感染试验，试 图通过体外培养来使该病毒增殖以期用于鸭黄病毒疫苗的研制。多篇文献报道指出，临床 分离到的鸭黄病毒可对多种细胞进行体外感染，如VERO细胞、BHK细胞等，但原代病毒培养 过程较为缓慢，病毒滴度不够高，对于疫苗的研发是一个需要解决的问题。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高鸭黄病毒病毒滴度的 培养方法，本发明所述的培养方法主要通过改变鸭黄病毒与细胞间的微环境，增加病毒与 细胞接触亲和度，从而大大提高鸭黄病毒病毒滴度。
[0004] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0005] 一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法，其包括以下步骤：
[0006] A、DMEM培养液的配制：将13. 4g DMEM干粉溶于IOOOml去离子水中，搅拌至完全 溶解后，调节PH值至6. 8?7. 8,并用彡0. 22um的无菌滤膜进行除菌过滤，置于彡4°C的冰 箱待用；
[0007] B、往上述的DMEM溶液中加入占 DMEM培养液体积1 %?8 %的胎牛血清后，接种细 胞进行单层培养；
[0008] C、待单层细胞培养好后，弃去培养容器内的DMEM培养液，并用无菌洗液洗2?3 次；
[0009] D、弃去无菌洗液，然后往培养容器内加入亲和剂和步骤A所述的DMEM培养液，其 中亲和剂的体积用量为DMEM培养液体积用量的0. 01%?1% ;
[0010] E、将培养容器置于细胞培养箱中静置培养Imin?30min后，接种鸭黄病毒，混合 均匀后置于细胞培养箱中培养2?5天，收获病毒液。
[0011] 具体地，步骤B中所述的细胞为Vero细胞、293细胞、ST细胞、BHK细胞中的一种。
[0012] 具体地，步骤C中所述的无菌洗液为去离子水、PBS缓冲液、无血清DMEM培养液中 的一种。
[0013] 具体地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：
[0014] 丙二酸0?1%; 磷酸 0?1%;
[0015] 山梨酸0?0·5%; 苹果酸 0·01?1%;
[0016] 无机盐0?3. 5%;去离子水余量。
[0017] 优选地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：
[0018] 丙二酸 0· 03 ?0· 08% ;磷酸 0.06 ?0.08%;
[0019] 山梨酸0.1?0.3%; 苹果酸 0.03?0.08%;
[0020] 无机盐0.05?3%; 去离子水余量。
[0021] 优选地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：
[0022] 丙二酸 0.05%;磷酸 0.08%;
[0023] 山梨酸0.3%; 苹果酸 0.05%;
[0024] 无机盐0.2%; 去离子水99.32%。
[0025] 具体地，所述无机盐为硫酸钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠中的一种或两种以上。
[0026] 具体地，所述的硫酸钠占亲和剂总量的0. 15?0. 3% ;所述的磷酸二氢钠占亲和 剂总量的0. 1-1. 6%;所述的氯化钠占亲和剂总量的0. 09-0. 9%;所述的氯化钾占亲和剂总 量的 0. 01-1%。
[0027] 具体地，所述的亲和剂是按以下步骤制备而成的：按配方量称取丙二酸、磷酸、山 梨酸、苹果酸、无机盐，将上述组分溶于配方量的去离子水中，过滤即得。
[0028] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0029] 本发明所述的培养方法主要是在培养过程中通过添加亲和剂，改变鸭黄病毒与细 胞间的微环境，增加病毒与细胞间亲和度，使鸭黄病毒更加快速地感染生产用细胞，提高了 鸭黄病毒对细胞的感染效率，从而可以在体外培养实验中更加快速地获得高病毒滴度的鸭 黄病毒，为鸭黄病毒的疫苗研发奠定基础。
[0030] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【具体实施方式】
[0031] 一种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法，其包括以下步骤：
[0032] A、DMEM培养液的配制：将DMEM干粉溶于去离子水中，搅拌至完全溶解后，调节pH 值至6. 8?7. 8,并用0. 22um的无菌滤膜进行除菌过滤，置于4°C的冰箱待用；
[0033] B、往上述的DMEM溶液中加入占 DMEM培养液体积1 %?8 %的胎牛血清后，接种细 胞进行单层培养；
[0034] C、待单层细胞培养好后，弃去培养容器内的DMEM培养液，并用无菌洗液洗2?3 次；
[0035] D、弃去无菌洗液，然后往培养容器内加入亲和剂和步骤A所述的DMEM培养液，其 中亲和剂的体积用量为DMEM培养液体积用量的0. 01%?1% ;
[0036] E、将培养容器置于细胞培养箱中静置培养Imin?30min后，接种鸭黄病毒，混合 均匀后置于细胞培养箱中培养2?5天，收获病毒液。
[0037] 具体地，步骤B中所述的细胞为Vero细胞、293细胞、ST细胞、BHK细胞中的一种。
[0038] 具体地，步骤C中所述的无菌洗液为去离子水、PBS缓冲液、无血清DMEM培养液中 的一种。
[0039] 具体地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：
[0040] 丙二酸0?1%; 磷酸 0?1%;
[0041] 山梨酸0?0.5%; 苹果酸 0.01?1%;
[0042] 无机盐0?3. 5%;去离子水余量。
[0043] 优选地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：
[0044] 丙二酸 0· 03 ?0· 08% ;磷酸 0.06 ?0.08%;
[0045] 山梨酸0.1?0.3%; 苹果酸 0.03?0.08%;
[0046] 无机盐0.05?3%; 去离子水余量。
[0047] 优选地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：
[0048] 丙二酸 0.05%;磷酸 0.08%;
[0049] 山梨酸0.3%; 苹果酸 0.05%;
[0050] 无机盐0.2%; 去离子水99.32%。
[0051] 具体地，所述无机盐为硫酸钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠中的一种或两种以上。
[0052] 具体地，所述的硫酸钠占亲和剂总量的0. 15?0. 3% ;所述的磷酸二氢钠占亲和 剂总量的0. 1-1. 6%;所述的氯化钠占亲和剂总量的0. 09-0. 9%;所述的氯化钾占亲和剂总 量的 0. 01-1%。
[0053] 具体地，所述的亲和剂是按以下步骤制备而成的：按配方量称取丙二酸、磷酸、山 梨酸、苹果酸、无机盐，将上述组分溶于配方量的去离子水中，过滤即得。
[0054] 实施例1 :
[0055] -种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法，其包括以下步骤：
[0056] A、DMEM培养液的配制：将13. 4g DMEM干粉溶于IOOOml去离子水中，搅拌至完全 溶解后，调节PH值至7. 0,并用0. 22um无菌滤膜进行除菌过滤，置于4°C的冰箱待用；
[0057] B、往上述的DMEM溶液中加入占 DMEM培养液体积5%的胎牛血清后，接种Vero细 胞进行单层培养；
[0058] C、待单层Vero细胞培养好后，弃去培养容器内的DMEM培养液，并用无菌去离子水 洗3次；
[0059] D、弃去无菌去离子水，然后往培养容器内加入亲和剂和步骤A所述的DMEM培养 液，其中亲和剂的体积用量为DMEM培养液体积用量的1 % ;
[0060] E、将培养容器置于细胞培养箱中静置培养30min后，接种鸭黄病毒，混合均匀后 置于细胞培养箱中培养3天，收获病毒液。
[0061] 具体地，步骤D中所述的亲和剂由以下按质量百分数计的各组分制备而成：
[0062] 丙二酸 0.5%;磷酸 0.5%;
[0063] 山梨酸0.5%;苹果酸 0.5%;
[0064] 无机盐2.9%;去离子水95.5%。
[0065] 其中，所述无机盐为硫酸钠、磷酸氢二钠、氯化钾的混合。
[0066] 其中，所述的硫酸钠占亲和剂总量的0. 3% ;所述的磷酸二氢钠占亲和剂总量的 1.6% ;所述的氯化钾占亲和剂总量的1%。
[0067] 具体地，所述的亲和剂是按以下步骤制备而成的：按配方量称取丙二酸、磷酸、山 梨酸、苹果酸、硫酸钠、磷酸氢二钠、氯化钾，将上述组分溶于配方量的去离子水中，过滤即 得。
[0068] 实施例2 :
[0069] -种提高鸭黄病毒病毒滴度的培养方法，其包括以下步骤：
[0070] A、DMEM培养液的配制：将13. 4g DMEM干粉溶于IOOOml去离子水中，搅拌至完全 溶解后，调节PH值至6. 8,并用0. 22um无菌滤膜进行除菌过滤，