一种h9n2亚型禽流感病毒的大规模培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物兽医生物技术领域，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒的大规 模培养方法。方法简单，易行，H9N2病毒在MDCK细胞上的快速适应，利用微载体与片状载 体相结合进行该流感病毒的大规模培养。
【背景技术】
[0002] H9N2亚型禽流感（Avian influenza，Al)是持续危害我国及世界养禽业发展的重 要禽类传染病之一。H9N2亚型禽流感是低致病性禽流感。典型暴发时，突然发病、感染率 高、传播范围大；非典型流行时，没有特征症状，主要引起产蛋下降、育雏及育成鸡疫苗免疫 失败。该病感染率高，传播范围广15?40日龄雏鸡多发；传播迅速，多日龄共存，大型鸡场 一旦受污染，很难将其清除。H9N2亚型禽流感引起免疫抑制、产蛋下降鸡群感染H9N2亚型 禽流感后主要呈现呼吸消化、生殖系统和全身组织器官轻度出血等症状和病变；可破坏免 疫系统，导致严重的免疫抑制，而易继发大肠杆菌或其他病原（IB、ND等）的感染，造成家 禽发病率和死亡率上升；引起产蛋鸡产蛋下降病愈后难以恢复原有水平。水禽中广泛存在 H9N2亚型禽流感病毒，并且外观健康的隐性感染。水禽是预防禽流感的最大隐患；H9N2除 感染禽外，对人的生命财产具有潜在的和现实的威胁。疫苗免疫是控制H9N2亚型AI的重 要措施之一，我国有多种不同厂家研制和生产H9N2亚型AI灭活疫苗，在我国大范围应用。
[0003] 我国获得许可的H9N2禽流感疫苗都为鸡胚来源的灭活疫苗。鸡胚是禽流感病毒 最为常用的一种培养基质，常用它来分离禽流感病毒和制备疫苗。但用鸡胚尿囊液分离或 传代禽流感病毒易引起抗原性变异；大规模生产时还存在鸡胚数量不足和潜在外源病毒污 染的问题。以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好 的维持病毒抗原稳定等优点，目前用于流感病毒增殖的细胞主要有MDCK和Vero细胞，其中 以MDCK细胞上病毒适应快，增殖滴度高，广泛用于禽流感病毒疫苗的研发。
[0004] 自从1996年以来，哺乳动物细胞已经发展到能够自由扩大培养并且用于工业化 生产，而禽流感疫苗也可以通过动物细胞大规模培养制备。生物反应器能够有效地增加单 位体积细胞培养的密度，从而为病毒性疫苗大规模生产奠定坚实的基础。以H9N2禽流感细 胞培养存在很多困难：1、病毒从鸡胚到细胞两种不同的培养基质转换需要适应过程；2、因 转瓶培养细胞量的限制，禽流感病毒HA效价不会高于2 6,不能满足疫苗制备的要求；3、在 病毒的吸附过程中必须更换添加 TPCK-胰酶的无血清培养基，其工艺复杂。因此，研发新的 生产工艺，使H9N2禽流感病毒快速在MDCK细胞上适应，从方瓶、转瓶、cytodexl为载体的 种子罐生物反应器快速到放大到操作简单的固定床篮式搅拌系统生物反应器工业化反应 器大规模生产重组H5亚型禽流感病毒是非常必要的。
[0005] 目前用于疫苗生产的大规模生物反应器主要为以cytodexl为载体搅拌式生物反 应器和聚酯片为载体的固定床式生物反应器。其中cytodexl为载体搅拌式生物反应器应 用广泛，可以提供放大工艺但是其工艺烦琐，不利于工厂化的简单操作，尤其是对接毒工艺 复杂的流感病毒。聚酯片为载体的固定床式生物反应器灌流及接毒工艺简单，但是不易放 大。中国专利号02112013. 7的发明专利说明书公开了一种利用Fibra-CeTMDisks为载体 大规模连续生产病毒疫苗的方法，虽然该工艺适合于狂犬疫苗、出血热、乙脑、小儿脊髓灰 质炎病毒，但是却不适合需要传代适应的流感病毒。中国专利号201010596058. 9的发明专 利说明书公开了利用Cytodexl为载体在生物反应器培养MDCK细胞增殖H9N2型禽流感病 毒。中国专利号201010159741. 6的发明专利说明书公开了生物反应器培养MDCK细胞全悬 浮培养工艺，以及增殖H9N2病毒制备疫苗的工艺。中国专利号201010282155. 0的发明专 利说明书公开了利用Cytodexl为载体在生物反应器培养MDCK或者细胞增殖工业化生产动 物流感病毒。
[0006] 以上文献资料都有不同程度的涉及禽流感病毒的生产工艺方法。但是，H9N2病毒 从鸡胚培养到MDCK细胞的快速适应，cytodexl为载体搅拌式生物反应器和聚酯片为载体 的工业化固定床篮式搅拌系统反应器的相结合的生产放大工艺并未涉及。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是在于提供了一种H9N2型禽流感病毒大规模培养方法，本方法中 H9N2病毒在MDCK适应快速，适应后病毒HA效价为28 ;以7. 5L反应器为种细胞罐，cytodexl 为载体培养MDCK细胞为种子细胞，放大到40L固定床篮式搅拌系统反应器的大规模培养， 收获血凝效价（HA)可以达到2 1QH9N2病毒80L。解决了目前H9N2禽流感病毒在MDCK细胞 上培养病毒滴度不能满足疫苗生产的难题。
[0008] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] -种H9N2亚型禽流感病毒的大规模培养方法，其步骤是：
[0010] 禽流感病毒H9N2快速适应MDCK细胞：
[0011] ① H9N2在MDCK细胞上的快速适应：F60-F105代MDCK细胞6孔板中长满单层，病 毒36. 5-37. 5°C吸附1-2小时，去除病毒液，以含TPCK-胰酶1. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM为 病毒稀释液清洗MDCK细胞2-4次后，更换含TPCK-胰酶0. 3-1. 8ug/ml高糖DMEM细胞维持 液，取血凝效价>24且病毒稀释倍数最高的病毒液或者致细胞最晚产生病变的最高稀释倍 数病毒作为种子病毒继续适应；病毒在6代以内适应MDCK细胞，且病毒血凝效价为2 8。
[0012] ②以F6-F11代次病毒为40L反应器种子病毒；其血凝效价彡28 ;EID50彡IO7 5
[0013] I. 7. 5L搅拌式反应器培养种子细胞：
[0014] 以Cytodexl为载体，2-10g/L载体投放量，以ρΗ7· 2的PBS水化并平衡载体 后，随罐体灭活，更换含8-10 % (体积比）新生牛血清DMEM完全培养基。细胞接种量 为0 . 35-1. 4*108个细胞/克载体，细胞贴壁阶段搅拌转速40r/min，DO为60 %，温度为 36-37°C，pH为7. 0-7. 3。细胞培养阶段依据细胞耗氧，搅拌转速控制40-80r/min，依据反 应器中糖浓度I. 8-2. 2g/L，培养调整灌流速度为5-40ml/min。细胞培养50-70小时细胞生 长至单层，细胞密度大约为I. 6-8. 3*106/ml。
[0015] 2. 7. 5L搅拌式反应器一40L篮式固定床反应器培养：
[0016] I) 40L固定篮式反应器准备：40L固定篮式反应器准备：按照40g/L取FibraCel Discs载体1440g，置于反应器中一起灭菌后，向反应器中加入32% (体积比）新生牛血清 的DMEM培养基至16L，使温度稳定至37 °C，pH为7. 2。
[0017] 2)消化7. 5L搅拌式反应器种子细胞接种到40L篮式固定床反应
[0018] 7. 5L反应器中细胞密度达到5. 3*106/ml，停止搅拌，载体沉淀后去除培养基，以 37°C预温热PBS清洗载体4次，含质量浓度0. 02%EDTA、0. 25%胰酶（37°C预温热）的消化液 清洗一次后，加入IL质量浓度0. 25%胰酶的消化液（37°C预温热)，同时25rpm搅拌20分钟 后，快速加入4L DMEM，搅拌转速调整25rpm后，通过软管快速抽取细胞和DMEM混合液3L至 提前准备好的40L反应器中。再次抽取3L DMEM加入7. 5L反应器中，调节搅拌转速至40rmp 搅拌5分钟后，降至25转，通过软管快速抽取细胞和DMEM混合液3L至反应器中，如此反复 操作5次。调节401^反应器转速至75印111、温度至35-371：、溶氧至30-90%、？!1为7.2。细 胞1小时内贴壁。
[0019] 3) 40L反应器中培养MDCK细胞
[0020] 细胞贴壁后调节40L反应器转速至75-120rpm、温度至37°C、溶氧至60%、pH为 7. 2。每6小时测糖浓度，大约24小时反应器糖浓度达到细胞生长所需要的极限值（I. 5g/ L)，随时调节灌流速度，使反应器培养基的糖浓度维持在I. 8-2. 8g/L。细胞在72小时左右 达到平台期，70小时以内细胞处于高活力状态，为病毒接种最佳时间。
[0021] 4)40L反应器中病毒接种H9N2流感病毒：40L反应器培养MDCK细胞接种病毒前， 依次用PBS、病毒稀释液(含I. 2-1. 5ug/ml TPCK-胰酶的DMEM)清洗细胞，病毒接种MOI为 0. 01-0. 00001 ;病毒吸附过程中TPCK-胰酶浓度I. 2-1. 5ug/ml，温度36. 5-37. 5°C，搅拌转 速40-60r/min，DO为60%，pH为7. 0-7. 6,病毒吸附2小时；病毒培养阶段细胞维持和病毒 培养温度为33-35°C，搅拌转速60-120r/min，4-6小时后更换细胞维持液。
[0022] 5) 40L反应器中病毒增殖及血凝效价监测：病毒培养阶段细胞维持和病毒培养 温度为33-35°C，搅拌转速60-120r/min，4-6小时后更换细胞维持液(含0. 2-0. 8ug/ml TPCK-胰酶的DMEM);灌流培养速度为50-400ml/min，糖浓度保持2. 2-3. Og/L。病毒培养 30小时开始监测病毒HA效价，病毒血凝效价达到22^4时，反应器进入产毒阶段，调节温度 为35 - 37°C，搅拌转速60-90r/min，糖浓度保持L 0-2. 8g/L，HA效价最高为211，可以收获 21°病毒液80L，另外3-4个反应器培养体积病毒液血凝效价2 7Λ
[0023] 3.病毒免疫效力评价：
[0024] 1)细胞毒的灭活及乳化：反应器生产病毒（HA效价为21°)经0. 05-0. 5%甲醛溶液 灭活，将灭活的病毒与油