假病毒颗粒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在大肠杆菌中表达MSJg病毒颗粒的方 法。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp，由编码成 熟酶蛋白（或A蛋白）、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子的基因组成， 每个MS2噬菌体病毒颗粒中包含180拷贝的外壳蛋白，一拷贝的成熟蛋白，及一分子的基因 组RNA。研究发现将MS 2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因以及包含基因调控序列的 5'非编码序列克隆到表达载体中，经过诱导表达后能够得到和野生噬菌体形态相同的病 毒样颗粒（virusal like particle, VLP)，该颗粒内部包裹有RNA分子，且具有耐核酸酶的 特性[2,3,4]。如果将外源基因片段插入到成熟酶包装位点的下游，表达载体表达时将噬菌体 基因和外源基因转录成重组RNA，同时外壳蛋白进行包装，得到可以包裹重组RNA的病毒样 颗粒，即Armored RNA病毒样颗粒。Armored RNA病毒样颗粒被广泛应用于RNA病毒检测 中质控品的构建，此外该病毒外壳还被作为疫苗载体使用，被用于一些病原微生物抗原表 位表面展示的载体。研究人员在应用该载体构建高致病性H5N1禽流感病毒多肽疫苗时发 现，按照现有技术（Pickett G G，Peabody D S. Encapsidation of heterologous RNAs by bacteriophage MS2Coat proein[J]. Nucleic Acids Res, 1993, 21(19):4621-4626. ；Cheng Yangjian, Niu Jianjun, Zhang Yongyou, et al. Preparation of His-Tagged armored RNA phage particles as a control for real-time reverse transcription-PCR detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus[J]. Journal of clinical microb iology, 2006, 44 (10) :3557-3561;窦敏，张国广，于广福，等。含口蹄疫病毒IRES RNA病毒 样颗粒表达载体的构建[J]。中国生物工程杂志，2007,27 (9) :31-35)构建的载体在大肠 杆菌细胞内诱导表达假病毒颗粒时产量较低，上述文献中均采用将噬菌体整个基因组 利用PCR扩增后连接入原核表达载体pET32a或pET28a等原核表达载体的多克隆位点，这 种载体在导入大肠杆菌细胞进行诱导表达时候有几个限制因素会影响假病毒颗粒相关蛋 白的表达，首先从菌体基因组结构分析外壳蛋白是位于成熟酶蛋白的下游，原核载体 蛋白表达时一般上游的基因先翻译表达，下游的基因后表达，但位于上游的成熟酶蛋白一 个病毒颗粒中只需要一个拷贝，若其过多表达肯定对下游的外壳蛋白基因的表达有一定影 响，而每一个病毒颗粒的衣壳构成中需要180个拷贝的外壳蛋白，成熟酶蛋白只需要一个 拷贝，显然要使表达载体多表达出假病毒颗粒，则外壳蛋白基因的大量表达是前提，原文献 这种构建方式显然影响了 pET32a等原核表达载体对克隆到其多克隆位点的噬菌体外壳蛋 白基因的表达能力。其次MS2噬菌体基因组插入的是原核表达载体的多克隆位点处，而所 使用的原核表达载体多克隆位点前都有较长的引导肽序列，这些引导肽的合成会消耗掉原 核细胞的部分翻译能力，也势必影响其下游基因的合成。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗 粒的方法。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] -种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)合成下列引物：
[0007] CP-F (SEQ ID NOl):
[0008] 5' -GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3'
[0009] CP-R (SEQ ID N02)：
[0010] 5' -GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3,
[0011] MP-F (SEQ ID N03)：
[0012] 5' -GCGGATCCTCCTAGGAGG TTTGACCTGT-3，
[0013] MP-R (SEQ ID N04)：
[0014] 5' -GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3'
[0015] Pac-F (SEQ ID N05)：
[0016] 5' ~GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG~3,
[0017] Pac-R (SEQ ID N06)：
[0018] 5' ~CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG~3,；
[0019] (2)用引物CP-F和CP-R通过PCR扩增出菌体的外壳蛋白基因序列；用引 物MP-F和MP-R通过PCR扩增出MS 2噬菌体的成熟酶基因序列；用引物Pac-F和Pac-R通 过PCR扩增出MS2噬菌体的包装位点基因序列；
[0020] (3)将上述外壳蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包装位点基因序列依次连接到 没有引导肽序列的原核表达载体中，得到重组载体；
[0021] (4)将重组载体转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，再依次收集菌体、破碎菌体、离心、 取上清液、过滤及纯化，即得所述MS 2假病毒颗粒。
[0022] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（3)具体包括如下步骤：
[0023] a、对所述没有引导肽序列的原核表达载体和上述外壳蛋白基因序列用NheI和 BamHI双酶切，再连接形成第一中间载体；
[0024] b、对上述第一中间载体和上述成熟酶基因序列用BamHI和HindIII双酶切，再连 接形成第二中间载体；
[0025] c、对上述第二中间载体和上述包装位点基因序列用HindIII和NotI双酶切，再连 接形成所述重组载体。
[0026] 在本发明的一个优选实施方案中，所述没有引导肽序列的原核表达载体为 pET21a〇
[0027] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（4)的大肠杆菌为BL21。
[0028] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（2)的PCR的模板为pMS27。
[0029] 本发明的有益效果是：
[0030] 本发明的方法将MS2噬菌体外壳蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包装位点基因 序列依次连接到没有引导肽序列的原核表达载体中，得到重组载体，该重组载体能够在大 肠杆菌中表达MS2噬菌体假病毒颗粒，且具有很高的表达量。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明的实施例1构建的重组载体的序列结构图，其中RBS为核糖体结合 位点，pac指噬菌体包装位点；
[0032] 图2为本发明的实施例2的SDS-PAGE实验结果图，其中1--对照载体pCPES未 加 IPTG诱导，2--对照载体pCPES加 IPTG诱导（箭头所示为诱导表达蛋白条带)，3-- pET2Ia-CMPc载体未加 IPTG诱导，4--pET2Ia-CMPc载体加 IPTG诱导(箭头所示为诱导表 达蛋白条带)，M-Marker ；
[0033] 图3为本发明的实施例4中表达的MS2假病毒颗粒的扫描电镜照片；
[0034] 图4为本发明的实施例5中RNase和/或DNase消化pET21a_CMPc载体的电泳照 片。
【具体实施方式】
[0035] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0036] 下述实施例中的pCPES来自于文献"窦敏，张国广，于广福，等。含口蹄疫病毒IRES RNA病毒样颗粒表达载体的构建[J]。中国生物工程杂志，2007,27 (9):31-35"构建，该载 体是将大肠杆菌噬菌体的基因组构建在载体pET32a中，同时在大肠杆菌基因组后插入了 口蹄疫的IRES片段基因。
[0037] pMS27质粒参见中国发明专利ZL200710008843. 6。
[0038] BL21 购自 novagen 公司。
[0039] 实施例1
[0040] 采用PCR扩增、酶切、连接等方法进行表达载体的构建；
[0041] (1)合成以下引物，引物由上海英骏生物公司合成，工具酶等购自大连宝生物公 司：
[0042] CP-F ：5' ~GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC~3,
[0043] CP-R ：5' -GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3'
[0044] MP-F ：5' -GCGGATCCTCCTAGGAGG TTTGACCTGT-3'
[0045] MP-R ：5' -GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3'
[0046] Pac-F ：5' -GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG-3;
[0047] Pac-R ：5' -CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3'
[0048] (2)以CP-F和CP-R为引物，以pMS27为模板（D. S. Pesbody教授惠赠)，扩增出外 壳蛋白基因序列，预计扩增片段长度为400bp左右，扩增体系为10XPCR bufferl.OyL， CP-F 和 CP-R (10 μ mol/L)均为 0· 5 μ L，dNTPO. 5 μ L，TaqDNA 聚合酶（5U/ μ L) 0· 3 μ L，质 粒pMS271. 0 μ L，超纯水补足总体积为20 μ L，反应程序为：94°C预变性5min ;然后94°C变性 45s，55°C退火45s，72°C延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸8min，4°C保存，PCR产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳确定目的条带。PCR扩增出的特异性片段，用NheI和BamHI双酶切，先 进行他61酶切，酶切体系为？〇?产物2(^1^，10\]\11311册^4以1^，他613以1^，超纯水补足至 40μ L 体系，37°C 酶切 4h 后，65°C 15min 终止反应，然后加入 IOXK buffer6y L，BamHI4y L， 超纯水10 μ L，37°C酶切4h。酶切产物1%凝胶电泳分离后，紫外箱内切割目的条带。凝胶回 收试剂盒回收酶切片段(上海华舜生物公司），凝胶回收步骤为1)在紫外灯下切取的相应待 回收DNA片段，放入I. 5mL的Ep管中，按IOOmg琼脂糖加入300 μ L Sl液的比例加入Sl液， 置50-60°C温浴lOmin，为使胶充分溶解，每隔2min摇晃一次；若琼脂糖重量低于lOOmg，用 水补齐至l〇〇mg。务必将琼脂糖充分溶解；2)如果回收片段小于300bp，则加入1/3S1体积 的异丙醇，混匀，50-60°C放置lmin，如果回收片段大于300bp，此步可跳过；3)将溶解液体 加至吸附柱中，l〇〇〇〇g离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放置同一个收集管中；4) 在吸附柱中加入500 μ L Wl液，IOOOOg离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放于同一 个收集管中；5)在吸附柱中加入500 μ L Wl液，室温静置lmin，IOOOOg离心15s，倒掉收集 管中的液体，将吸附管放于同一个收集管中；6) IOOOOg离心lmin，将吸附柱放于另一个干 净的1.5mLEP管中，在吸附膜的中间加30μLTl液，静置lmin，10000g离心lmin，-2(rC 保存待用。如果室温低于20°C，可延长室温放置时间，或在37°C温浴lmin，以保证DNA充分 洗脱。回收的酶切DNA片段与同样酶切凝胶回收纯化(按照上述酶切PCR扩增DNA片段的 步骤操作）的原核表达载体pET21a连接（Novagen公司产品)，连接反应体系为（总体积为 10μL) :pET21a载体片段lμL，T4DNA连接酶lμL，10XT4DNAbuf?erlμL，目的片段7μ