狂犬病病毒减毒株及其选育方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒疫苗领域，特别是以生物学手段选育高度减毒而且免疫原性良好 的狂犬病减毒活疫苗株。
【背景技术】
[0002] 狂犬病病毒（rabies virus, RABV/RV)属弹状病毒科（rhabdoviridae)狂犬病病 毒属（lyssavirus)，为不分节段的单链RNA有包膜病毒。依血清型和基因型可以将狂犬病 病毒分为4个血清型和7个基因型。狂犬病病毒可以引起人类和动物的狂犬病，一旦发病， 病死率几乎100 %。我国是全世界狂犬病最为流行的国家之一，近年来全国狂犬病死亡人数 在2000人左右，仅次于印度排在全球第二位。
[0003] 对人体接种疫苗虽然是预防控制人狂犬病发生的有效途径，但其无法完全控制和 消除狂犬病，尤其在养犬多的发展中国家，根本的措施在于对犬及其它狂犬病自然宿主实 施免疫控制传染源。目前针对动物的预防接种主要有注射免疫和口服免疫两种方式，与传 统的注射免疫相比，口服免疫具有操作方便，安全性高、使用范围广（可以应用于家犬、流 浪犬以及野生动物的免疫）等优点，尤其避免了注射免疫时犬只咬伤工作人员的风险。欧 美等国家应用狂犬病毒减毒株或重组病毒株研制的口服疫苗广泛地应用于野生动物狂犬 病的免疫，取得了对野生动物和人间狂犬病的有效控制。WHO鼓励发展中国家应用减毒活疫 苗于家犬和流浪犬，以便提高犬的接种率，减少传染源，控制人间狂犬病。但目前中国还缺 乏符合WHO标准的疫苗株可用于制备减毒活疫苗。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供能够达到WHO标准的高度减毒、免疫原性好、遗传稳定性 高的狂犬病病毒减毒株及其培育方法，为制备减毒口服活疫苗提供生产用毒种。
[0005] 本发明的目的是这样实现的：一种狂犬病病毒减毒株的选育方法，其特征在于： 选用与我国人用狂犬病疫苗生产用毒种CTN-I-V株同源的CTN-181毒株作为亲本株，培育 步骤至少包含：
[0006] (I)CTN-ISl毒株在体外细胞系培养和动物体内组织的交替传代以及运用空斑纯 化技术进行克隆筛选；
[0007] (2)利用不同日龄小鼠脑内残余神经毒力筛选获得两株减毒株，分别命名为 CTN-1-3 和 CTN-1-19 ;
[0008] (3)CTN-l-3和CTN-1-19减毒株的扩增、滴定及检定；
[0009] (4)对减毒株CTN-1-3和CTN-1-19的全基因组序列测定，获得CTN-1-3全基因组 序列如SEQ ID NO :1所示，CTN-1-19株全基因组序列如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 本发明的目的还可以下述方式实现：步骤⑴CTN-181毒株在体外细胞系培养和 动物体内组织的交替传代以及运用空斑纯化技术进行克隆筛选的具体操作方法为：亲本 株CTN-181株在豚鼠颁下腺、叙利亚仓鼠肾细胞BHK-21交替连续传3代，最后在叙利亚 仓鼠肾细胞BHK-21细胞上挑取20个空斑，空斑呈针尖状，大小直径在1mm，编号依次为 CTN-I-(1-20)〇
[0011] 本发明的狂犬病病毒减毒株CTN-1-3全基因组序列如SEQ ID NO :1所示； CTN-1-19全基因组序列如SEQ ID NO :2所示。
[0012] 本发明的目的还在于提供狂犬病病毒减毒株CTN-1-3和CTN-1-19在制备狂犬病 口服活疫苗中的应用。
[0013] 本发明狂犬病病毒减毒株的培育和筛选，在申请人原有选育的我国人用狂犬病疫 苗生产用毒种CTN-I-V株同源的CTN-181毒株的基础上进行以下研宄，包含（a)毒株在体 外细胞系培养和动物体内组织的交替传代以及运用空斑纯化技术进行克隆筛选；(b)克隆 毒株的制备、滴定及检定；(c)利用不同日龄小鼠脑内残余神经毒力筛选减毒株；（d)减毒 株经口服、肌肉接种的免疫原性；(e)减毒株经乳鼠脑内、豚鼠颁下腺回传的遗传稳定性； (f)减毒株的全基因组序列测定，掌握其全基因组序列特征并了解减毒的分子基础。
[0014] 本发明的优点和显著效益：本发明所筛选到的两株狂犬病病毒减毒株CTN-1-3、 CTN-1-19株来源于我国自行分离鉴定的狂犬病病毒CTN株，具有毒种背景清楚、传代历史 明确，与我国近年分离的街毒株同源性较高等优点。其残余毒力很低、免疫原性良好和遗传 稳定性十分稳定，已经达到或者超过了 WHO《口服狂犬病疫苗研发指导原则》中关于候选毒 株安全性和有效性的相关要求，适合作为狂犬病口服活疫苗的生产用毒种，有望弥补我国 在口服狂犬病疫苗方面的空白，可进一步应用于野生动物及流浪犬只的狂犬病预防接种。
【附图说明】
[0015] 图1是CTN-1-3、CTN-1-19株筛选流程图；
[0016] 图2是CTN-1-3、CTN-1-19株基因组结构示意图
[0017] 图中标明数字由上到下分别表示：
[0018] 基因组全长（11923);
[0019] 五个开放阅读框核苷酸数目（1353, 891，609, 1575, 6387);
[0020] 对应编码的氨基酸数目（450, 297, 202, 524, 2130);
[0021] 先导序列、末尾序列及编码区中间的间隔序列（58, 91，86, 211，516, 130);
[0022] 中间五个字母表示五种蛋白，分别是核蛋白（Nucleoprotein, N)、磷蛋白 (Phosphoprotein，P)、基质蛋白（Matrix Protein, M)、糖蛋白（Glycoprotein, G)和转录酶 大蛋白(Large Protein, L)
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图，通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本 发明的保护范围。
[0024] 实施例1、狂犬病病毒CTN-181和CTN-181-SG株的适应性传代和空斑纯化
[0025] 一、狂犬固定毒人二倍体细胞适应传代和空斑纯化
[0026] 狂犬病病毒CTN株由申请人分离自山东淄博狂犬病人脑组织，在小鼠脑内传56代 获得固定毒株CTN-M株，又经人胚肺二倍体细胞株（KMB-17)，细胞传代至80代，将第80代 毒种按中性红空斑纯化3次获得CTN-181株。
[0027] 二、豚鼠颁下腺传代
[0028] 取CTN-181株以原液颈部皮下注射数只豚鼠，每只接种1ml，于接种后第二天取豚 鼠2只，用CO 2处死，3%来苏水泡5分钟，将豚鼠捞出仰面放在双层纱布上，用一把剪刀剪