专利名称：细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒毒价的方法
技术领域：
本发明涉及狂犬病病毒毒价的测定方法，尤其是涉及一种细胞蚀斑测定狂犬病病 毒毒价的方法。
背景技术：
目前，狂犬病病毒毒价的测定方法普遍采用小鼠半数致死量(LD50)。LD50测定方 法需要用活体动物，活体动物的个体差异将会给检测结果带来很大的影响；而且LD50测定 周期长，14日后才能判定结果，这样势必会延长疫苗生产中半成品检验周期。另外，细胞蚀斑法也是狂犬病病毒毒价测定的一种有效方法。病毒感染细胞后，通 过半固体或固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增 殖周期，便形成一个局限性病变区域，即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑就是由最初感染 细胞的一个病毒颗粒形成，因而可通过病毒颗粒计数测定毒价。通过用甲基纤维素或琼脂 等介质防止释放的病毒颗粒在介质中流动，以便将蚀斑控制在适当的范围内。为便于肉眼 观察，常用结晶紫等染料染色，活细胞层染成深紫色，由于病变细胞不吸收染料，细胞板内 圆形不着色的透明区域即为一个蚀斑单位。病毒悬液的滴度可以用每毫升蚀斑形成单位 (PFU/ml)来表示。在实际操作中，需要配置合适的介质，有效地控制接种条件和反应条件才 能获得可靠的测定结果。国内外已报道狂犬病病毒蚀斑实验周期为5 10日，蚀斑形成的时间依然较长。 此外，蚀斑测定法存在对实验条件要求严格、操作步骤复杂、蚀斑不易形成或不能形成、再 现性差等缺点，到目前仍未形成标准的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒毒价的方 法，包括以下步骤1)将甲基纤维素与细胞维持液按照1 99 2 98的质量比混合，使甲基纤维 素充分溶解，得到质量百分比浓度为 2%的甲基纤维素覆盖培养基；2)消化处于对数生长期的细胞后，用细胞生长液稀释，得到细胞密度为 lX105cells/ml 5X 105cells/ml 的细胞悬液；3)用细胞维持液以10倍系列稀释待测定的狂犬病病毒液，得到IO4 IO8倍系列 稀释梯度浓度狂犬病病毒液；4)将步骤2)所述细胞悬液与步骤3)所述狂犬病病毒液，以体积比9 1的比例加 入到细胞培养板的细胞培养孔中，同时取步骤2)所述的细胞悬液与步骤1)所述的细胞维 持液，以体积比9 1的比例加入到细胞培养板的细胞培养孔中作为阴性对照，置于36°C 38CO2培养箱中培养6 12h，细胞贴壁后形成细胞层，弃去所述细胞培养板中的上清 液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞；5)在细胞培养孔中加入步骤1)所述甲基纤维素覆盖培养基Iml 2ml，作为覆盖层，置于33°C 36°C，CO2培养箱中继续培养72 96h后，加入染色液染色，观察细胞培养 板的各培养孔的蚀斑数，以蚀斑数计算待测定的狂犬病病毒液的毒价。优选地，本发明所述甲基纤维素覆盖培养基中含有50 80mmol/L的HEPES。优选地，本发明所述细胞维持液为含有50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和3% (ν/ ν)的牛血清的MEM。优选地，本发明所述细胞生长液为含50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和6% (ν/ν) 的牛血清的MEM。优选地，本发明所述CO2培养箱中CO2体积含量为2% 10%。优选地，本发明所 述染色液为0. 5% 1. 5% (w/v)的结晶紫、0.01% 0. (w/v)中性红或0.5% 5% (w/v)碘液中任一种。技术效果本发明的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，采用单层细胞培养，具有对病毒 蚀斑反应所特有的敏感性、重复性和特异性。其次，本发明采用的细胞维持液、细胞生长液能够促进病毒与细胞吸附。而且在病 毒蚀斑的细胞生长液与维持液中，均添加了 DEAE-Dextran，甲基纤维素培养基溶液中还添 加了 50 80mmol/L的HEPES，因此能够大大加快蚀斑的形成，缩短了狂犬病毒检测的周期。最后，甲基纤维素覆盖培养基配制方法是将灭菌甲基纤维素粉末直接溶于维持液 中，制备方法简单。综上所述，甲基纤维素培养基溶液中含有50 80mmol/L的HEPES，能够加快蚀斑 的形成；此方法持续周期短，3 4日即可用肉眼判定结果，并且特异、敏感，重复性好，操作 简便，经济，易于推广；解决了狂犬病病毒因无明显细胞病变而不易测定的问题，具有一定 应用价值；既可用于病毒克隆，还可用于病毒的测定和中和抗体的检测，给狂犬病病毒的研 究带来了较大的方便。
图1为蚀斑的肉眼观察图；
图2为蚀斑的显微镜照片。
具体实施例方式本发明试验了甲基纤维素与细胞维持液的比例采用1 99 2 98的质量比， 优选地，使用1 99的质量比，得到质量百分比浓度为的甲基纤维素覆盖培养基。本发明试验了在细胞培养孔中加入细胞悬液与狂犬病病毒液，CO2培养箱中培养 6 12h，细胞贴壁后形成细胞层，优选地，在细胞贴壁形成单层细胞层后，继续下面的检测步骤。本发明试验了甲基纤维素培养基中使用了 50 80mmol/L HEPES,优选地，本发明 实施例中使用了 50mmol/L的HEPES，而且在培养初期在配制的覆盖层中直接加入50mmol/L 的HEPES，不仅简化操作步骤，同时还可以使蚀斑形成时间进一步提前。本发明试验了细胞生长液和细胞维持液中加入50 100 μ g/ml DEAE-Dextran, 也可以促进蚀斑形成，缩短观察检测时间。
本发明试验了 0. 5% 1. 5% (w/v)的结晶紫、0. 01 % 0. 1 % (w/v)中性红或 0. 5% 5% (w/v)碘液三种不同的染色剂对培养3 4日的细胞进行染色，均能形成清晰 蚀斑，优选0. 5% 1. 5% (w/v)的结晶紫。本发明实施例中，病毒株为Flury-LEP毒株(中国兽医药品监察所，菌种号 AV2012)，其他本领域常用的病毒如Flury-HEP毒株、ERA毒株、CTN-I毒株和aG毒株等也可 用于本发明之方法进行病毒含量测定。本发明实施例中，传代细胞为BHK-21细胞(幼仓鼠肾传代细胞)，其他本领域常 用的传代细胞如Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、PK-2A细胞(猪肾细胞)、HamSter Kidney 细胞(地鼠肾细胞)和CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)等也可用于本发明之方法进行病毒含
量测定。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1配制MEM基础液取9. 6g MEM溶于1000ml水中，然后加入2. 2g NaHCO3，并用Imol/ L的HCl或NaOH调整pH值至7. 2，并加入DEAE-Dextran使其浓度为80 μ g/ml，无菌过滤后 作为IXMEM基础液，不加血清的MEM培养基作为基础液。在1 XMEM基础液中添加3%体积 百分比的牛血清作为细胞维持液；在IXMEM基础液中添加6%体积百分比的牛血清作为细 胞生长液；取部分维持液加入终浓度为50mmol/L的HEPES备用。该细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，包括以下步骤(1)将已灭菌的甲基纤维素与含有50mmol/L HEPES的维持液按照1 99质量比 混合，4°C放置3日以上，使甲基纤维素充分溶解，得到质量百分比浓度为的甲基纤维素 溶液，作为覆盖层；临用时于37°C水浴中预热；(2)消化处于对数生长期的BHK-21细胞，用生长液稀释处于对数生长期的BHK-21 细胞，使细胞密度为2. 5X 105cells/ml，得到BHK-21细胞悬液；(3)用维持液以IO1UO2UO3UO4UO5UO^IO7UO8倍系列稀释待测定的狂犬病病毒 液，得到梯度浓度狂犬病病毒液；(4)将所述细胞悬液按0. 9ml/孔加入到细胞培养板中；(5)将所述梯度浓度狂犬病病毒液按0. Iml/孔加入到步骤(4)中得到的已含有细 胞悬液的细胞培养板中，同时设置阴性对照，置于CO2培养箱中培养，CO2培养箱的CO2体积 含量为5%，温度为37°C ；(6)6 12h细胞贴壁后，弃去所述细胞培养板中的上清液，用摩尔浓度为 0. Olmol/L、pH值为7. 2的灭菌PBS冲洗一遍，直到死亡细胞完全脱落；然后每孔加入步骤 (1)所配制的质量百分比浓度为1 %的甲基纤维素覆盖培养基Irnl，作为覆盖层，置于CO2培 养箱中继续培养，CO2培养箱的CO2体积含量为5%，温度为35°C ；(7) 96h后弃去覆盖层，并用浓度为0. Olmol/L.pH值为7. 2的灭菌PBS冲洗三遍， 直至将甲基纤维素冲洗干净；然后每孔加入lml、l%质量百分比的结晶紫溶液，室温条件 (25°C)下染色20min后，用自来水缓缓冲洗15min，直至染色液冲洗干净，晾干，肉眼观察细 胞培养板的各培养孔的蚀斑数；
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(8)阴性对照无蚀斑出现的细胞培养板，判为有效板，根据有效板的各培养孔的蚀 斑数、接种的待测定的狂犬病病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的狂犬病病毒液的毒 价。图1和图2中箭头所示分别为眼观和显微镜下观察的病毒蚀斑，图1中Bl B5 对应的稀释度分别为待测狂犬病毒1X ΙΟ4、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8稀释倍数，每个稀 释度4个孔重复。B3的4个孔蚀斑数分别是15、16、12、10，4个孔的蚀斑数均在8 30个 范围之内，因此B3所对应1 X IO6为最适稀释倍数，如前所述，ν (每孔接种的病毒体积)为 0. lml，根据公式计算A(PFU/ml) = (15+16+12+10)/4 X 106/0· 1 = 1. 33 X IO8 (PFU/ml)本发明所述的测定方法操作简单、可控性强、批间误差小，根据实验结果批间误差 小于logl0°_2，能够实现狂犬病病毒毒价的标准化测定，并且缩短了狂犬病疫苗生产中半成 品的检验周期。批间误差的计算方法是将同一待检狂犬病病毒液，小量分装，超低温保存，分10 次试验来检测这一待检毒样，10次检测的结果取对数，并计算10个样本总体的标准偏差后 得到的数值。同一病毒液重复检验10次，检验结果用对数表示分别为8. 33,8. 42,8. 18,8. 24、 8. 02,8. 15,8. 35,8. 08,8. 33,8. 27，计算总体样本标准偏差为 0. 12，即为 IoglO012o以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒毒价的方法，其特征在于，包括以下步骤1)将甲基纤维素与细胞维持液按照1∶99～2∶98的质量比混合，使甲基纤维素充分溶解，得到质量百分比浓度为1％～2％的甲基纤维素覆盖培养基；2)消化处于对数生长期的细胞后，用细胞生长液稀释，得到细胞密度为1×105cells/ml～5×105cells/ml的细胞悬液；3)用细胞维持液以10倍系列稀释待测定的狂犬病病毒液，得到104～108倍系列稀释梯度浓度狂犬病病毒液；4)将步骤2)所述细胞悬液与步骤3)所述狂犬病病毒液，以体积比9∶1的比例加入到细胞培养板的细胞培养孔中，同时取步骤2)所述的细胞悬液与步骤1)所述的细胞维持液，以体积比9∶1的比例加入到细胞培养板的细胞培养孔中作为阴性对照，置于CO2培养箱中培养6～12h，细胞贴壁后形成细胞单层，弃去所述细胞培养板中的上清液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞；5)在细胞培养孔中加入步骤1)所述甲基纤维素覆盖培养基1ml～2ml，作为覆盖层，置于CO2培养箱中继续培养72～96h后，加入染色液染色，观察细胞培养板的各培养孔的蚀斑数，以蚀斑数计算待测定狂犬病病毒液的毒价。
2.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步骤1) 中所述甲基纤维素覆盖培养基中含有50 80mmol/L的HEPES。
3.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步骤2) 中所述的细胞为BHK-21细胞、Vero细胞、PK-2A细胞、Hamster Kidney细胞和CEF细胞。
4.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征是步骤1)、3) 中所述的细胞维持液为含有50 100 μ g/mlDEAE-Dextran和3%体积百分比的牛血清的 MEM0
5.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步骤2) 所述的细胞生长液为含50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和6%体积百分比的牛血清的MEM。
6.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步骤4) 中细胞培养孔中细胞贴壁后形成单层细胞。
7.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步骤4)、 5)中的所述CO2培养箱中CO2体积含量为2% 10%。
8.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步骤4) 中所述培养温度为36°C 38°C。
9.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步骤5) 中所述培养温度为33°C 36°C。
10.根据权利要求1所述的细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步骤5) 中的染色剂为0. 5% 1. 5% w/v的结晶紫、0. 01% 0. 1% w/v中性红或0. 5% 5% w/v 碘液。
全文摘要
本发明提供一种细胞蚀斑快速测定狂犬病病毒毒价的方法，其包括以下步骤(1)配制甲基纤维素覆盖培养基；(2)制得细胞悬液；(3)稀释待测定的狂犬病病毒液，得到梯度浓度狂犬病病毒液；(4)将所述细胞悬液与狂犬病病毒液，以体积比9∶1的比例加入到细胞培养板的细胞培养孔中，置于CO2培养箱中培养；(5)弃去细胞培养板中的上清液，将甲基纤维素覆盖培养基加至培养孔中，置于CO2培养箱继续培养；(6)结晶紫染色，观察细胞培养板的各培养孔的蚀斑数，以蚀斑数计算待测定狂犬病病毒液的毒价。该测定方法操作简单，快速准确，可控性强、批间误差小，缩短了狂犬病病毒毒价的检验周期。
文档编号C12Q1/70GK101921877SQ20101027319
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年5月31日
发明者乔荣岑, 孙进忠, 张许科 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司