一种细胞生长调节剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种细胞生长调节剂，包括以下成分和数量：乙基环丙沙星：100毫克；多种细胞提取液：50-100ml；水解乳蛋白：5克；N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2磺酸(HEPERS)：3克；最低营养需求培养基(MEM)：1升；配好的液体用0.2μm滤膜过滤除菌，分装在4℃可短期保存，-20℃可以长期保存。根据需要添加40％～60％所述细胞生长维持调节剂到正常的细胞培养液中进行细胞培养，中途不更换培养液，使细胞整个维持周期延长2～3倍，能用于细胞微量中和实验，病毒蚀斑滴定实验等方面。长成的细胞在进行生物学实验前更换含有40％～60％生长维持调节剂的维持液，可使细胞维持周期延长2倍左右，用于病毒抗原生产等方面。
【专利说明】—种细胞生长调节剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞生长调节剂，属于生物细胞【技术领域】。
【背景技术】
[0002]组织细胞培养是生物学的一个关键技术，广泛用于生物学研究、病毒疫苗抗原生产、试剂生产(如单克隆抗体)生产等各个方面。传代细胞是一种可以长期培养的细胞，一般用培养瓶进行培养，当细胞长成一定的密度后，除了少部分进行传代以扩大细胞数量外，大部分用于各种生物学生产和生物实验。在培养瓶中长成后用于生物学实验的细胞，在37°C中由于细胞密度太高、营养液营养耗尽等原因会在5~15天内老化死亡，这段时间叫细胞维持时间，也就是细胞能够用于生物实验的时间。不同的细胞株维持时间有区别，一般在37°C下为5~15天。在某些生物学生产和生物学实验中，细胞5~15天维持时间是不够的，如有一些病毒在细胞中生长速度慢，在一些关键实验如病毒蚀斑滴定实验中，由于在细胞维持时间内病毒没有有效生长，使得实验无法获得正确的结果。另外，延长细胞维持时间有助于提高病毒疫苗抗原、以及细胞分泌物的产量，对于细胞培养为基础的生物制品生产等有显著的影响。
[0003]目前，除了不断更换培养液体外没有其它方法来延长细胞维持时间，而更换培养液这种方法在病毒培养、细胞分泌物生产方面是不可行的。有的疫苗生产厂家可能会通过加大抗生素、补充血清等方法来延长细胞维持时间，但这些方法可能没有任何效果。
[0004]细胞老化的主要原因是有效营养不足、培养液PH变化、无抗老化成分等。针对这些方面，我们进行了研究。研究发现细胞需要的营养不是简单的添加蛋白质、氨基酸、维生素能够实现的，而某些物质更 能够有效的满足细胞的营养需要，添加这些成分以及PH稳定剂和某些抗生素等能够有效的延长细胞维持时间。根据研究结果研究出的生长调节维持液，添加到细胞培养液中，可以延长细胞维持时间达2~3倍，对VeiO细胞的实验结果表明，37°C下温箱中细胞维持时间可以达30天以上。该能够满足生物学研究、生物制品生产各个方面的需要。而目前所用方法不能够有效延长细胞维持时间，多次更换培养液最多只能延长细胞维持期I~2天，而且该方法在病毒培养、细胞分泌物生产方面是不可行的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种细胞生长调节剂，以便解决细胞维持时间短的问题。该发明可以使细胞维持时间增加2~3倍，能够有效的解决细胞维持时间短的问题。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0007]一种细胞生长调节剂，包括以下成分和数量:乙基环丙沙星:100毫克；多种细胞提取液:多种细胞提取液:50-100ml ;水解乳蛋白:5克；N_(2_羟乙基)哌嗪-N’ _2磺酸(HEPERS):3克；最低营养需求培养基(MEM):1升；配好的液体用0.2 μ m滤膜过滤除菌，分装在4°C可短期保存，~20°C可以长期保存。
[0008]根据需要添加40%~60%细胞生长维持调节剂到正常的细胞培养液中进行细胞培养，中途不更换培养液，使细胞整个维持周期延长2~3倍，可用于细胞微量中和实验，病毒蚀斑滴定实验等方面。
[0009]而长成的细胞在进行生物学实验前更换含有40%~60%生长维持调节剂的维持液，可使细胞维持周期延长2倍左右，可用于病毒抗原生产等方面。
[0010]在上述中，乙基环丙沙星为抗生素，高效防止污染，抗老化重要成分。多种细胞提取液，满足细胞特殊营养需要；水解乳蛋白，补充细胞营养需要；HEPERS为PH稳定剂；MEM含有各种氨基酸、维生素。
[0011]该发明的有益效果在于:
[0012](I)本发明技术能够使细胞生长维持时间延长2~3倍，采用疫苗生产常用的BHK21和VeiO细胞进行实验(其中，BHK21细胞:仓鼠肾细胞，广泛用于狂犬病、口蹄疫等疫苗的生产；Veix)细胞:非洲绿猴细胞，广泛用于多种疫苗如狂犬病、乙脑等疫苗生产)，结果表明在正常情况下，BHK21的维持时间为9天左右，VeiO细胞维持时间为10天左右，添加细胞生长维持调节剂后，BHK21维持时间增加到20天，Vero细胞维持时间增加到30天，证明添加细胞生长维持调节剂可提高BHK21和Vero细胞在37°C中维持时间2倍以上。
[0013](2)细胞培养用于病毒生产中时,细胞维持时间对病毒抗原的产量会有一定的影响，对于某些生长速度慢的病毒，细胞维持时间长病毒抗原产量自然会提高。本发明采用生长较慢的病毒，蓝舌病病毒(Blue~Tongue Virus, BTV)来进行实验，分别用常规方式和细胞生长调节维持液进行病毒培养，收获的病毒进行毒价测定，结果实验组的毒价提高了近一个滴度，相当于病毒含量提高了 10倍。【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明实施例中不添加任何成分时对BHK21细胞维持作用变化图(A:第5天；B、第7天；C、第9天；D、第10天)。
[0015]图2是本发明实施例中添加30 %细胞生长调节维持液时对BHK21细胞维持作用变化图(A:第5天；B、第7天；C、第9天；D、第10天；E、第18天)。
[0016]图3是本发明实施例中添加50 %细胞生长调节维持液时对BHK21细胞维持作用变化图(A:第5天；B、第7天；C、第9天；D、第10天；E、第18天)。
[0017]图4是本发明实施例中不添加任何成分时对Vero细胞维持作用变化图(A --第5天;B、第10天；C、第15天)。
[0018]图5是本发明实施例中30%细胞生长调节维持液时对Vero细胞维持作用变化图(A:第5天；B、第10天；C、第15天；D、第20天；E、第30天)。
[0019]图6是本发明实施例中30%细胞生长调节维持液时对Vero细胞维持作用变化图(A:第5天；B、第10天；C、第15天；D、第20天；E、第30天)。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和实施例对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
[0021]实施例
[0022]一种细胞生长调节剂，包括以下成分和数量:乙基环丙沙星:100毫克；多种细胞提取液多种细胞提取液:50-100ml ;水解乳蛋白:5克；N-(2-羟乙基)哌嗪-N’ _2磺酸(HEPERS):3克；最低营养需求培养基(MEM):1升；配好的液体用0.2 μ m滤膜过滤除菌，分装在4°C可短期保存，~20°C可以长期保存。
[0023]根据需要添加40%~60%细胞生长维持调节剂到正常的细胞培养液中进行细胞培养，中途不更换培养液，使细胞整个维持周期延长2~3倍，可用于细胞微量中和实验，病毒蚀斑滴定实验等方面。
[0024]而长成的细胞在进行生物学实验前更换含有40%~60%生长维持调节剂的维持液，可使细胞维持周期延长2倍左右，可用于病毒抗原生产等方面。
[0025]在上述中，乙基环丙沙星为抗生素，高效防止污染，抗老化重要成分。多种细胞提取液，满足细胞特殊营养需要；水解乳蛋白，补充细胞营养需要；HEPERS为PH稳定剂；MEM含有各种氨基酸、维生素。
[0026]本发明技术中，能够使细胞生长维持时间延长2~3倍，采用疫苗生产常用的BHK21和Vero细胞进行实验，结果表明在正常情况下，BHK21的维持时间为9天左右，Vero细胞维持时间为10天左右，添加细胞生长维持调节剂后，BHK21维持时间增加到20天，Vero细胞维持时间增加到30天，证明添加细胞生长维持调节剂可提高BHK21和Vero细胞在37°C中维持时间2倍以上，具体结果参见图1、图2、图3、图4、图5、图6。
[0027]该细胞培养用于病毒生产中时，细胞维持时间对病毒抗原的产量会有一定的影响，于某些生长速度慢的病毒，细胞维持时间长病毒抗原产量自然会提高。本发明采用生长较慢的病毒，蓝舌病病毒(Blue~Tongue Virus, BTV)来进行实验，分别用常规方式和细胞生长调节维持液进行病毒培养，收获的病毒进行毒价测定，结果实验组的毒价提高了近一个滴度，相当于病毒含量提高了 10倍。
[0028]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种细胞生长调节剂，其特征在于:包括以下成分和数量:乙基环丙沙星:100毫克；多种细胞提取液:50-100ml ;水解乳蛋白:5克；N_(2_羟乙基)哌嗪_N’_2磺酸(HEPERS):3克；最低营养需求培养基(MEM):1升；配好的液体用0.2 μ m滤膜过滤除菌，分装在4°C可短期保存，-20°C可以长期保存。
2.根据权利要求1所述的细胞生长调节剂，其特征在于:根据需要添加40%~60%所述细胞生长维持调节剂到正常的细胞培养液中进行细胞培养，中途不更换培养液，使细胞整个维持周期延长2~3倍，能用于细胞微量中和实验，病毒蚀斑滴定实验等方面。
3.根据权利要求1所述的细胞生长调节剂，其特征在于:长成的细胞在进行生物学实验前更换含有40%~60%生长维持调节剂的维持液，可使细胞维持周期延长2倍左右，用于病毒抗原生产等方 面。
【文档编号】C12N5/071GK103667178SQ201310714812
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】李乐, 高林, 苗海生, 何于雯, 李华春 申请人:云南省畜牧兽医科学院