一种检测TP53Pro72Arg位点突变的方法及引物的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种高敏感性TP53Pro72Arg位点突变的检测方法，它包括：(i)特异性引物对：SEQNO1及SEQNO2；(ii)特异性检测探针：SEQNO3、SEQNO4，且将MGB基团修饰于两条探针的3端，以增加特异性。本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。
【专利说明】—种检测TP53Pro72Arg位点突变的方法及引物
【技术领域】
[0001]本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种高敏感性的TP53Pro72Arg位点突变检测方法。
【背景技术】 [0002]TP53基因(tumor protein p53)是目前发现的与肿瘤相关性最高的一种抑癌基因，且常与其他的基因协同作用，是多种肿瘤的分子标志物。TP53位于人类染色体17pl3上，编码拥有393个氨基酸的蛋白，该蛋白包括3个主要的结构域:N末端反式激活位点中间的DNA结合区域和C末端寡聚位点，该基因的蛋白产物是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子，当细胞受到各种理化或生物因素的影响致使DNA受损时，TP53使细胞停止于G1/S期，让细胞修复损伤而重新进入细胞周期，如损伤未能修复则促进细胞凋亡。
[0003]TP53基因存在多个突变位点，如国内外研究热点Pro72Arg点突变。该位点位于TP53的第72个密码子，突变发生在DNA结合位点的氨基酸上，可使TP53蛋白关键性的DNA接触位点消失而失活。突变的TP53蛋白可通过“负显性效应”阻碍野生型TP53基因的抑制生长功能。野生型蛋白可激活邻近TP53蛋白一DNA结合位点上p21基因的表达，突变型TP53蛋白则丧失这一活性；突变型蛋白与野生型蛋白结合形成几乎没有结合DNA能力的寡聚蛋白复合物，从而不能控制这些位点的基因转录，这些位点可能包括抑制细胞或癌变的基因，这样突变型蛋白将导致肿瘤进一步生长。
[0004]目前，国内外诸多研究显示TP53Pro72Arg突变与肺癌的发生和预后均有一定相关性。颜丽莉指出Pro72Arg的Arg/Pro和Pro/Pro型与亚洲人群的肺癌易感性相关；同样,Sakiyama及Fan也得出了相似的结论,等位基因Pro携带者的肺癌患病风险较高；孙宁等发现携带72P/R基因型的晚期NSCLC病人较72P/P型病人对钼类药物化疗的敏感性趋向于降低，而72R/R型病人较携带72P/P型病人对化疗的敏感性却趋向于增高，Bergamaschi及Sullivan也指出携带野生型Tp53基因72R的病人对顺钼、阿霉素等抗癌药的敏感性明显高于携带72P者，生存期及无病进展期也长。
[0005]此外，已有的文献也指出Pro72Arg突变与白血病AML及CML患者的预后存在相关性，例如Camelo等研究了 R72P突变与伊马替尼治疗CML效果的相关性，实验中共收集85例CML患者样本，其中27例为Arg/Arg型，Pro/Pro型12例，其余为Arg/Pro型。当使用伊马替尼后，Arg/Arg型患者的治疗失败率显著高于其余两种型，且Arg/Arg型中高于40岁的患者，其失败的风险更高；而针对AML患者的预后，Shi等研究结果显示，当AML患者经过化疗后，Pro72Arg突变的Arg/Arg型患者获得的治疗效果最差。
[0006]因此，了解患者的TP53Pr072Arg基因型情况，将有助于相关疾病的预后判断及治疗方案的制定。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于，提供一种高效灵敏的检测TP53Pro72Arg位点突变的寡核苷酸，包括PCR扩增引物，所述的PCR扩增引物为SEQ NOl和SEQ N02:
[0008]SEQ NOl:CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
[0009]SEQ N02: CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT ；
[0010]进一步地，还包括检测探针为SEQ N03和SEQ N04:
[0011]SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
[0012]SEQ N04:HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT-MGB。
[0013]进一步地，SEQ N03能结合野生型TP53的扩增产物。
[0014]进一步地，SEQ N04能结合突变型TP53的扩增产物。
[0015]本发明还提供了一种检测TP53Pro72Arg位点突变的方法，包括:
[0016](I)样本 DNA 提取；
[0017](2) Real-time PCR扩增反应，以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物和特异性检测探针，将所有引物及探针加入同一PCR反应管中进行Real-time PCR扩增，其中:PCR扩增引物为SEQ NOl和SEQ N02，分别是:
[0018]SEQ NOl:CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
[0019]SEQ N02: CGTAG CTGCCCTGGTAGGTT ；
[0020]检测探针为SEQ N03和SEQ N04,分别是:
[0021]SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
[0022]SEQ N04: HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT-MGB ；
[0023](3)结果分析,根据Real-time PCR结果来分析样本的Pro72Arg突变型。
[0024]进一步地，总Real-time PCR 扩增体系为 25ul:包括 2*qPCR MIX12.5ul、引物 SEQNOl 和 SEQ N02 各 0.8ul、探针 SEQ N03 和 SEQ N04 各 0.4ul、灭菌水 8.1ul、DNA 模板 2ul。
[0025]进一步地，Real-timePCR 反应程序:95°C 5min 预变性；95°C 15s，62°C 30s。
[0026]进一步地，结果分析中，若样本只产生一条扩增曲线，则根据相对应的探针判断其突变型；若样本产生两条扩增曲线，则判定样本为杂合突变型。
[0027]本发明的有益效果:目前，对于检测TP53Pro72Arg突变型的常用方法为DNA测序，但该法检测周期需要1-2天，且操作复杂，容易污染；而本发明的检测周期只需半天，相对于前者缩短了 I倍多，且全程为闭管检测，因此具有较短的检测周期和理想的污染控制。本发明通过特异性引物及MGB探针扩增目标序列，并直接根据Real-time PCR结果图谱分析该位点基因型，可在同一 PCR反应管中检测纯合突变型，杂合型，野生型，避免了临床漏检，同时将本发明检测结果与DNA测序结果对比，发现两者结果一致(见附图2~7)，说明本发明具有较高的准确性。因此，本发明具有操作简单、检测周期短、特异性高、准确度高、条件依赖少和污染风险低等优点。检测结果将有助于临床医生更好地根据个体差异进行相关疾病的预后判断及治疗方案的制定。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是TP53的4号外显子标准序列，其中Pro72Arg位点已方框标记。
[0029]图2是样本A的Real-time PCR结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQN03,因此A样本为野生型，即Pro/Pro型。
[0030]图3是样本B的Real-time PCR结果。由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQN04，因此B样本为纯合突变型，即Arg/Arg型。
[0031]图4是样本C的Real-time PCR结果。由于产生两条扩增曲线，因此C样本为杂合突变型，即Arg/Pro型。
[0032]图5~7是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图2~4的结果，最终发现与Real-time PCR检测结果一致。
【具体实施方式】
[0033]下面结合 具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0034]实施例1
[0035]检测TP53Pro72Arg位点突变的寡核苷酸，包括PCR扩增引物和探针。所述的PCR扩增引物(SEQ NOl，SEQ N02)和检测探针(SEQ N03, SEQ N04)为:
[0036]SEQ NOl: CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
[0037]SEQ N02: CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT ；
[0038]SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
[0039]SEQ N04:HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT_MGB。
[0040]其中在SEQ N03和SEQ N04的3端标记了 MGB，用于增强检测特异性。SEQ N03能结合野生型TP53的扩增产物，SEQ N04能结合突变型TP53的扩增产物。
[0041]实施例2
[0042]检测TP53Pro72Arg位点突变的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中:
[0043]qPCR 试剂为 2*qPCR MIX、50*R0X、扩增引物 SEQ NOl 和 SEQ N02、探针 SEQ N03 和SEQ N04、灭菌水，其中:
[0044]SEQ NOl:CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
[0045]SEQ N02: CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT ；
[0046]SEQ N03:FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
[0047]SEQ N04:HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT_MGB。
[0048]阳性对照品:含有TP53序列的溶液。
[0049]阴性对照品:无TP53序列的溶液。
[0050]空白对照品:2 ill生理盐水或不加任何物质。
[0051]所述试剂盒的使用方法包括如下步骤:
[0052](i )提取样本中的DNA
[0053](ii)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQ NOU SEQ N02)、检测探针(SEQ N03、SEQ N04)进行 Real-time PCR 扩增；
[0054](iii)根据Real-time PCR结果来分析样本的Pro72Arg突变型。
[0055]通过几百例临床受检样本用本试剂盒中的引物和探针(SEQ NOU SEQ N02、SEQN03、SEQ N04)进行Real-time PCR扩增，发现其具有较高的稳定性、特异性、灵敏度；同时使用Sanger测序法对相同的受检样本进行测序，结果两类方法的检测结果完全一致，说明本方法具有极高的检测准确性。
[0056]实施例3:
[0057]检测TP53Pro72Arg位点突变的方法，包括
[0058]1、DNA 提取
[0059](I)抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。1000Orpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min),吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
[0060](2)加入20 μ I蛋白酶K溶液，混匀后加入200 μ I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0061](3)加人200 μ I无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0062](4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0063](5)向吸附柱CB3中加入500 μ I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0064](6)向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0065](7)向吸附柱083中加入50(^1漂`洗液1^，12，000印111(13，400\8)离心30秒，倒掉废液。
[0066](8)将吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(13, 400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0067](9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μ I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm(13, 400 X g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0068]2、PCR 扩增
[0069]一例样本的总 Real-time PCR 体系为 25ul:2*qPCR MIX12.5ul、引物 SEQ NOl 和SEQ N02 各 0.8ul、探针 SEQ N03 和 SEQ N04 各 0.4ul、灭菌水 8.lul.DNA 模板 2ul。
[0070]Real-time PCR 反应程序:95°C 5min 预变性；95°C 15s，62°C 30s。
[0071]3、结果分析，具体为:若样本只产生一条扩增曲线，则根据相对应的探针判断其突变型；若样本产生两条扩增曲线，则判定样本为杂合突变型。
[0072]实施例4:临床样本检测
[0073]取待检的临床样本A、B、C，按实施例3的方法提取DNA、配制溶液并检测。
[0074]样本A的Real-time PCR结果如图2所示，由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQ N03,因此A样本为野生型，即Pro/Pro型。
[0075]样本B的Real-time PCR结果如图3所示，由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQ N04，因此B样本为纯合突变型，即Arg/Arg型。
[0076]样本C的Real-time PCR结果如图4所示，由于产生两条扩增曲线，因此C样本为杂合突变型，即Arg/Pro型。
[0077]为了验证图2~4的结果,对样本A、B、C进行sanger测序，图5~7是样本A、B、C的sanger测序图谱，表明sanger检测结果 与本发明所述的检测结果一致。这一结果表明本发明具有操作简单、检测快速，灵敏度高，有助于临床医生更好地进行预后判断。
【权利要求】
1.检测TP53Pro72Arg位点突变的寡核苷酸，包括PCR扩增引物，所述的PCR扩增引物为 SEQ NOl 和 SEQ NO 2:
SEQ NOl: CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
SEQ N02:CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，还包括检测探针为SEQN03和SEQN04:
SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
SEQ N04:HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT-MGB。
3.如权利要求2所述的寡核苷酸，其特征在于，SEQN03能结合野生型TP53的扩增产物。
4.如权利要求2所述的寡核苷酸，其特征在于，SEQN04能结合突变型TP53的扩增产物。
5.一种检测TP53 Pro72Arg位点突变的方法，包括: (1)样本DNA提取； (2)Real-time PCR扩增反应，以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物和特异性检测探针，将所有引物及探针加入同一 PCR反应管中进行Real-time PCR扩增，其中:PCR扩增引物为SEQ NOl和SEQ NO 2，分别是:
SEQ NOl: CGGACGATATTGAACAATGGTTC ；
SEQ N02: CGTAGCTGCCCTGGTAGGTT ； 检测探针为SEQ N03和SEQ N04，分别是:
SEQ N03: FAM-AGGCTGCTCCCCCCGT-MGB ；
SEQ N04: HEX-AGGCTGCTCCCCGCGT-MGB ； (3)结果分析，根据Real-timePCR结果来分析样本的Pro72Arg突变型。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，总Real-timePCR扩增体系为25ul:包括2*qPCR MIX 12.5ul、引物 SEQ NOl 和 SEQ N02 各 0.8ul、探针 SEQ N03 和 SEQ N04 各 0.4ul、灭菌水 8.1ul、DNA 模板 2 ul。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于，Real-timePCR反应程序:95°C 5min预变性；95°C 15s，62。。30s。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，结果分析中，若样本只产生一条扩增曲线，则根据相对应的探针判断其突变型；若样本产生两条扩增曲线，则判定样本为杂合突变型。
【文档编号】C12N15/11GK103740818SQ201310715004
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】陈奕磊, 李文静, 王淑一 申请人:广州艾迪康医学检验所有限公司