鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记及其鉴别方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了鸡新城疫病毒抗体水平相关的两种分子标记，分别位于SEQ?ID?NO：2所示序列中的第50位碱基处的G/A碱基突变，及SEQ?ID?NO：3所示序列中的第167位碱基处的T/C碱基突变。还提供了这两种分子标记的鉴别方法及其在鸡新城疫病毒抗体水平性状方面的分子标记辅助选择中的应用。这两种分子标记均是以鸡ROBO2基因的DNA序列为模板，选择SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3及所示的引物进行扩增。本发明所使用的检测方法准确性高、成本低。通过对上述G/A及T/C突变位点的检测，在育种过程中选择TT或者GG基因型的个体，在不影响鸡生长性状的前提下，提高鸡新城疫病毒抗体水平。
【专利说明】鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记及其鉴别方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及鸡标记辅助选择【技术领域】，具体地说，是涉及用于鸡标记辅助选择的鸡新城疫病毒抗体水平相关的两种分子标记及其鉴别方法和应用。
【背景技术】
[0002]新城疫是由新城疫病毒引起的严重危害家禽养殖的呼吸道传染病，新城疫病毒属于副粘病毒科。新城疫在我国各地均有发生，具有发病率和死亡率相对较高，成年蛋鸡产蛋率、蛋品质下降，饲料报酬低等危害，给养禽业带来了巨大的经济损失。目前在家禽养殖过程中都是通过接种疫苗来预防新城疫，但是随着新城疫疫苗免疫密度的提高和广泛应用，养殖成本进一步提升。同时，一些鸡群尽管按照免疫程序开展了新城疫疫苗防疫，但是由于病毒免疫应答水平存在个体差异，仍然会出现非典型鸡新城疫疫情。宿主对新城疫的抗性研究仍是一种挑战，我们前期利用鸡高密度单核苷酸多态性芯片进行全基因组关联分析发现与鸡新城疫病毒抗体水平密切相关的基因组区域，该基因组区域内的R0B02基因上的突变与新城疫病毒抗体水平极显著相关。该基因是影响鸡对新城疫病毒免疫应答的候选基因。但目前从遗传的角度来说，还没有建立有关R0B02基因作为鸡新城疫病毒抗体水平分子标记的检测方法，同时该基因作为鸡新城疫病毒抗体水平分子标记辅助选择也未见应用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记及其鉴别方法和应用。
[0004]本发明通过克隆与鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的cDNA全长序列，寻找该基因编码区的突变位点以及相应的多态性检测方法，通过性状关联分析的应用，为鸡的标记辅助选择提供有用的分子标记。另外本发明还涉及分子标记的鉴别方法以及在鸡标记辅助选择上的应用。
[0005]本发明克隆得到与鸡新城疫抗体水平相关基因R0B02的全长cDNA序列，该全长cDNA序列包括完整的编码区序列及3’ UTR和5’ UTR,如序列表SEQ ID NO:1所述，该序列全长为5269bp。
[0006]本发明通过对上述克隆所获得的cDNA片段分析，结果发现可作为鸡标记辅助选择应用的两种分子标记，这两种标记与鸡新城疫病毒抗体水平相关。
[0007]分子标记一的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，在该序列的第50位的G碱基突变为A碱基；该突变位点位于鸡R0B02基因的全长cDNA序列的1418bp处，如序列表SEQ ID N0:1所示。因此，为了方便表述，将标记一的G/A突变命名为1418G>A。
[0008]分子标记二的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，在该序列的第167位碱基处T/C碱基突变。T碱基突`变为C碱基，导致AIu1-RFLP多态性；该突变位点位于鸡R0B02基因的全长cDNA序列的2462bp处，如序列表SEQ ID NO:1所示。因此，为了方便表述，将标记二的T/C突变命名为2462T>C。
[0009]分子标记一(1418G>A):以鸡R0B02基因的DNA序列(参考序列GeneBank登录号为NC_006088.3)为模板，设计引物扩增该基因部分序列。扩增所得到的序列包括部分第5外显子，如序列表SEQ ID NO:2所述，该序列全长为87bp。所用的引物为:
[0010]RS-exon5-F:5，-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3，，
[0011]RS-exon5-R: 5’-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3’。
[0012]分子标记二(2462T>C):以鸡R0B02基因的DNA序列(参考序列GeneBank登录号为NC_006088.3)为模板，设计引物扩增该基因部分序列。扩增所得到的序列包括完整的第12外显子和部分第11内含子、部分第12内含子，如序列表SEQ ID NO:3所述，该序列全长为286bp。所用的引物为:
[0013]RS-exon12-F: 5’ -TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3’，
[0014]RS-exon12-R:5’-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3’。
[0015]本发明的第二个目的是提供了两种分子标记的鉴别方法。
[0016]分子标记一(1418G>A):以鸡R0B02基因的DNA序列为模板，通过焦磷酸测序仪，利用RS-exon5-F/RS-exon5-R引物进行扩增，PS-exon5_SR引物进行测序，可以准确判断该突变位点的基因型。因为在扩增引物的正向引物RS-eXon5-F的5’末端做生物素标记，设计了反向的测序引物，所以测序结果为TT基因型，则是发生突变的AA基因型，测序结果为CC基因型，则是没有发生突变的GG野生型，测序结果为TC基因型，则是杂合型AG。
[0017]用到的引物:
[0018]扩增引物RS-exon5-F:5’-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3’(5’ 末端标记有生物素)，
[0019]扩增弓I 物 RS-exon5-R: 5’ -TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3’。
[0020]测序引物PS-exon5_SR:5' -CTTCTTCCAGCGGAC-3，。
[0021]分子标记二(2462T>C):以鸡R0B02基因的DNA序列为模板，利用RS-exonl2_F/RS-exon 12-R引物进行扩增，将PCR扩增所得到的产物利用AluI内切酶进行酶切反应，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。该序列上存在2个AluI内切酶识别位点一 “AGTC”，其中一个识别位点位于该序列的第257-260位，该区域没有突变位点，所以被检测个体均可以在该序列处切开为258bp和28bp两条序列，但是由于28bp的序列太短了，琼脂糖凝胶电泳检测不到该序列对应的条带。如果只有一条258bp的条带，则DNA双链在该突变位点处均为C碱基，判断为CC基因型；若有两条分别为165bp和93bp的条带，则说明DNA双链在该突变位点处均为T碱基，判断为TT基因型；若有三条分别为258bp、165bp和93bp的条带，则说明DNA双链在该突变位点处一条链为C碱基，另一条链为T碱基，判断为TC基因型。
[0022]本发明的第三个目的是提供该分子标记在鸡分子标记辅助选择中的应用，特别是鸡新城疫抗体水平选择育种中的应用。
[0023]通过本发明所提供的技术方案，还可以制备成该两种分子标记的鉴别试剂盒。
[0024]本发明的有益效果是，通过对上述G/A或者T/C突变位点的检测，能知道目标鸡群新城疫抗体水平这一免疫性状的基因型，从而能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡群新城疫抗体水平的一致性。另外，本发明所使用的检测方法准确性高、成本低、效率高。【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为利用引物CtlF/CtlR克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的部分cDNA片段I的电泳图片；
[0026]图2是利用引物Ct2F/Ct2R克隆所得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的部分cDNA片段2的电泳图片；
[0027]图3是利用5’ RACE克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的5’ UTR片段的电泳图片；
[0028]图4是利用3’ RACE克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的3’ UTR的电泳图片；
[0029]图5是实施例1中鸡R0B02基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记一(1418G>A)的片段的电泳图片，片段大小为87bp (琼脂糖胶浓度为1.5%)；
[0030]图6是实施例1中鸡R0B02基因外显子5上的G/A突变位点(分子标记一:1418G>A)的三种基因型(GG，AA和AG)的焦磷酸测序结果；
[0031]图7是实施例1中鸡R0B02基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记二(2462T>C)的片段的电泳图片，片段大小为286bp (琼脂糖胶浓度为1.5%)，其中，M泳道为DNA分子量标准(DL2000)；
[0032]图8是本发明中鸡R0B02基因外显子12上的AIu1-RFLP的三种基因型(TT，TC和CC)电泳图谱(琼脂糖胶浓度为2.0%)，`M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
【具体实施方式】
[0033]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0034]序列表SEQ ID NO:1是本发明将所获得的鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记R0B02全部序列利用DNAStar中的SeqMan程序拼接成一条完整的cDNA序列，包含3621bpCDS 全长，662bp5’ UTR 和 986bp3，UTR。
[0035]序列表SEQ ID NO:2是本发明克隆的第一只国内地方鸡种“惠阳胡须鸡” R0B02基因包括分子标记一(1418G>A)在内的核苷酸序列。
[0036]序列表SEQ ID NO:3是本发明克隆的第一只国内地方鸡种“惠阳胡须鸡”R0B02基因包括分子标记二(2462T>C)在内的核苷酸序列。
[0037]实施例1:鸡新城疫抗体水平分子检测方法的建立
[0038](一)R0B02基因cDNA序列克隆
[0039]以鸡R0B02基因的mRNA序列(参考序列GeneBank登录号为XM_416674.3)为模板，设计两对引物CtlF/CtlR，Ct2F/Ct2R克隆得到如图1和图2所示的cDNA序列；图1为利用引物CtlF/CtlR克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的部分cDNA片段I的电泳图片；图2是利用引物Ct2F/Ct2R克隆所得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的部分cDNA片段2的电泳图片。根据所获得的cDNA序列设计三条下游引物5GSP-R1、5NGSP-R2以及5NGSP-R3，以SMART cDNA为模板，用上述三条下游引物和5’ RACE引物扩增该基因的5’末端，得到1279bp的扩增产物，其序列如图3所示，图3是利用5’ RACE克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的5’ UTR片段的电泳图片。根据所获得的cDNA序列设计两条上游游引物3GSP-F1、3NGSP-F2，以SMARTcDNA为模板，用上述两条上游引物和3’ RACE引物扩增该基因的3’末端，得到1518bp的扩增产物，其序列如图4所示，图4是利用3’ RACE克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02的3’ UTR的电泳图片。
[0040]将上述所获得的四条序列利用DNAStar中的SeqMan程序进行拼接得到鸡R0B02基因的cDNA全长，其序列如序列表SEQ ID NO:1所示。该序列是本发明将所获得的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因R0B02全部序列利用DNAStar中的SeqMan程序拼接成一条完整的 cDNA 序列，包含 3621bp CDS 全长，662bp5’ UTR 和 986bp3’ UTR。
[0041]扩增R0B02基因cDNA序列的引物如下所示(分4段扩增):
[0042]第一段:扩增部分cDNA序列
[0043]CtlF:5’ -GCGAGTGGAAACTGACAAAGATGAT-3’，
[0044]CtlR:5’ -TATGGGTTGTGGCTCACTTTTCACT-3’。
[0045]第二段:扩增部分cDNA序列
[0046]Ct2F:5’-CTACCGAGTAATGTATCGCCAAACG-3’，
[0047]Ct2R:5’-AGGAGGTTGTGTATTGCTTTGGATG-3’。
[0048]第三段:5’RACE 扩增 5’ UTR
[0049]5 ‘RACE 上游引物:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATC
[0050]AACGCAGAGT-3’/5 ’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ ，
[0051]5GSP-R1:5’-CATCCTTCTTCCAGCGGACGGTCGG-3’。
[0052]5 ‘RACE 上游槽式引物:5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，
[0053]5NGSP-R2:5’-TCCAGTAGATGGTAGGCTCAGGGTGTCC-3’ 。
[0054]5 ‘RACE 上游槽式引物:5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，
[0055]5NGSP-R3:5’-CATAACTTCCTTCGTCAGGTTTACTCC-3’ 。
[0056]第四段:3’ RACE 扩增 3 ’ UTR
[0057]3GSP-F1:5’ -GTGTTCCCCTCCCACCCCCTCCTGT-3’，
[0058]3 ‘ RACE 下游引物:5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATC
[0059]AACGCAGAGT-3’/5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ 。
[0060]3NGSP-F2:5’-TTCATCACCTGCGATCTCCTTTGGG-3’ ，
[0061]3 ‘RACE 下游槽式引物:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。
[0062](二)PCR 扩增条件:
[0063]总体积为25yL的PCR反应体系中加入DNA模板I μ L，2 XPCR反应混合物
12.5 μ L，IOmM引物前后各I μ L，Taq DNA聚合酶0.625U，双蒸水8.25 μ L，PCR反应条件为:94°C预变性3min ;94°C变性30s，退火温度见表1，表1为引物的退火温度和延伸时间的列表。退火时间45s，72°C延伸时间见表1，共35个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0064]表1:引物的退火温度和延伸时间
[0065]
【权利要求】
1.鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括分子标记一和分子标记二: 所述分子标记一为如SEQ ID NO:2所示序列中的第50位碱基处G/A碱基突变， 所述分子标记二为如SEQ ID NO:3所示序列中的第167位碱基处T/C碱基突变。
2.一种鉴别权利要求1所述的分子标记一的方法，其特征在于，包括以下步骤:以鸡ROB02基因的DNA序列为模板，选择如下引物进行扩增及焦磷酸测序检测: RS-exon5-F:5’ -AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3’，其中该引物序列的5’末端标记有生物素， RS-exon5-R:5’-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3’，
PS-exon5-SR:5’-CTTCTTCCAGCGGAC-3’ ； 若测序结果为TT基因型，则是发生突变的AA基因型； 若测序结果为CC基因型，则是没有发生突变的GG野生型； 若测序结果为TC基因型，则是AG杂合型。
3.一种鉴别权利要求1所述的分子标记二的方法，其特征在于，包括以下步骤:以鸡ROB02基因的DNA序列为模板，选择如下引物扩增:
RS-exonl2-F:5’-TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3’，
RS-exonl2-R:5’-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3’ ； 将所得扩增产物用限制性内切酶AluI酶切， 若只有一条带，则该突变位点处均为C碱基； 若有二条带，则突变位点处均为T碱基； 若有三条带，则说明该突变位点处一条链为C碱基，另一条链为T碱基。
4.权利要求1所述的分子标记在鸡新城疫病毒抗体水平性状方面的分子标记辅助选择中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为在鸡新城疫病毒抗体水平选择育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103725688SQ201310714390
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】王艳, 舒鼎铭, 瞿浩, 王劼, 罗成龙, 李宝红 申请人:广东智威农业科技股份有限公司, 广东省农业科学院动物科学研究所