专利名称：一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片及制备方法
技术领域：
本发明公开一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片及芯片制备方法，用于狂犬病病毒 属诊断与分型的基因芯片(或寡核苷酸微阵列)，属于生物技术领域。
背景技术：
狂犬病是一种所有温血动物都易感的人兽共患病，狂犬病的病原属于Lv。Lv属 弹状病毒科力i/oririi/ae)单分子负链RNA病毒目iMononegavimles\具有高度的嗜 神经性，常常引起人和动物的致命性脑脊髓炎。Lv主要包括7种基因型，分别为基因1型 经典狂犬病病毒Rabies Virus (RABV)；基因2型的Lagos bat virus (LBV)；基因3型的 Mokola virus (MOKV) ；4 M的 Duvenhage virus (DUVV) ；5 M的 European bat lyssavirus 1 ^BLV-I)；基因 6 型的 European bat lyssavirus 2 (EBLV-2)；基因 7 型的 Australian bat lyssavirus (ABLV)0目前我国人和动物的狂犬病野外分离株均属于基因 1型，尚无基因2 7型病毒自然感染病例的报道。有效地检测病原是狂犬病流行病学调查的基础，由于同属的病毒常引起相同的临 床症状，常规的免疫诊断和PCR检测难以同时完成Lv的诊断与分型。目前常用基因分型检 测的方法整个过程繁琐，费用高，获得结果时间长。因此建立一种Lv快速有效的诊断与分 型方法显得十分重要。基因芯片技术是一种大规模集成的固相杂交技术，其基本原理是核 酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理，以大量已知序列的寡核苷 酸、cDNA或基因片段作为探针，检测样品中与其互补的核酸序列，通过特定的检测系统对杂 交信号进行检测，并配以计算机系统对每一杂交信号数据定性、定量分析和处理，迅速得出 待测品的基因序列及表达的信息。与传统基因诊断技术相比，基因芯片技术具有明显的优 势，具备微型化、高通量、高度平行性和快速性的显著特点。目前基因芯片技术已被广泛应 用于发现与疾病相关的新基因、基因表达分析、药物研究与开发和对生物样品中各种已知 或未知病毒性病原体进行筛查、鉴定与分型的研究等。因此利用基因芯片技术对Lv诊断分 型可弥补现有诊断方法的不足。根据检索，2009年英国VLA实验室R. Gurrala等人利用随机PCR标记样品的方法 结合基因芯片技术，建立了对Lv的芯片诊断与分型的方法。但是随机PCR扩增本身存在偏 性以及非特异性扩增，即大量扩增某一区域的基因或不依赖模板的非特异性扩增，使得扩 增产物中病毒核酸的含量低，导致基因芯片的灵敏度降低，还易造成非特异性杂交。而本 发明利用了特异性扩增Lv的7个基因型的通用引物(本发明人申请的，专利号ZL 2007 1 0056129. 4)，针对每个基因型设计了并筛选了特异性的探针，不但提高了芯片的整体检测 灵敏性，而且增加了芯片的特异性。虽然目前的研究报道显示，我国Lv的野外分离株均属于基因1型，但是针对我国 不同时期、不同省份狂犬病流行毒株的生态学、分子流行病学和遗传多样性的研究数据尚 不充分，无法排除其他基因型的Lv的存在；同时考虑到大陆架构的特点，Lv易感物种分布 的多样性，以及我国加入WTO后对外贸易和人口流动增多的实际情况，建立一种快速、灵敏、特异性强的，可以同时对Lv的多种基因型诊断和分型的技术成为我国狂犬病防治工作 的主要内容之一。
发明内容
本发明公开一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片及芯片制备方法，用于狂犬病病毒 属诊断与分型的基因芯片(或寡核苷酸微阵列)，克服了现有的Lv诊断和分型方法灵敏度 低，技术繁琐，成本高和试验周期长的缺点。本发明公开的狂犬病病毒属诊断与分型芯片，其特征如下
醛基修饰的玻璃基片，点样区、探针矩阵、标签区，固定到玻片上的寡核苷酸探针组成， 寡核苷酸探针5’端经氨基化修饰(见图1)；
本发明公开狂犬病病毒属诊断与分型芯片的制备方法如下
(1)光学级醛基修饰的玻璃基片和点样液；
(2)设计与合成Lv基因型特异探针
设计探针根据GenBank数据库中登录的Lv各基因型全基因序列和N基因序列，利用 生物信息学软设计寡核苷酸探针。阳性对照探针为与目的基因同源型低的PGM-T载体序列 设计，阴性对照探针根据拟南芥的基因组设计。所有寡核苷酸探针5’端氨基化修饰，人工 合成。(3)芯片点制设计及点样后处理
设计的点样矩阵为15行14列，探针整体分布呈“时钟型”(附图2)。寡核苷酸探针用 芯片点样液稀释，使用MicroGrid II芯片点样仪将探针通过机械针印迹于醛基修饰的玻璃 基片上。点好的芯片水合固定，室温避光干燥、洗涤、封闭液封闭甩干后密封即为成熟芯片。本发明的有益效果在于
(1)可以对Lv各型别的病毒检测具有高的灵敏性、特异性和准确性；
(2)能早期、快速、准确的检测和区分Lv的7种已知型别的病毒；
(3)能够发现不同型别的Lv的混合感染；
(4)能高通量地对临床样品进行检测与分型，单张芯片一次可完成12个样品的检测， 同时可以操作多张芯片；
(5)通过使用特定的仪器和分析软件可对杂交信号定量分析，并提供严谨而精确的数据。总之，本发明涉及的Lv检测和分型的方法基于基因芯片技术和PCR核酸扩增与标 记技术。将基因芯片技术应用于Lv的检测与分型领域，并提供了一种操作简便、重复性好 的使用方法。初步临床应用试验结果表明，本芯片能特异、准确地和快速地对临床狂犬病样 品中的Lv检测和分型。
图1本发明所述Lv诊断与分型12样品检测芯片正面芯片尺寸为25. 2士0. 2mmX75. 5士0. 2mmXl. 0士0. 5mm ；探针矩阵区尺寸为 2mm士0. 5mm X 2mm士0. 5mm ；点样区的尺寸为 7mm士0. 5mmX7mm士0. 5mm ；Barcode 为标签 区，尺寸为7mmX20mm。单张芯片上有12个探针矩阵，可同时检测12份样品，本芯片可在_20°C避光长期保存3个月以上。图2本发明所述Lv诊断与分型芯片探针矩阵为便于观察杂交图谱，点样探针设计为“时钟型”矩阵，所述探针排布为 点样图12点钟方向为阳性质控对照(Quality Control )、阴性对照(Negative Control)探针分布点阵，各6个探针点；
中心与四角4个探针点为质控探针点样区，共8个； 1点钟到2点钟方向为经典狂犬病病毒RABV探针点阵，共12个； 3点钟方向为Lv基因2型(LBV)探针点阵，共14个； 4点钟到5点钟方向为L基因3型(MOKV)探针点阵，共17个； 6点钟方向为Lv基因4型(DUVV)探针点阵，共12个； 7点钟到8点钟方向为Lv基因5型(EBLV-I)探针点阵，共12个； 9点钟方向为Lv基因6型(EBLV-2)探针点阵，共20个； 10点钟到11点钟方向为Lv基因7型(ABLV)探针点阵，共14个。图3本发明所述Lv诊断与分型芯片对Lv的7个基因型病毒芯片检测结果；
A为只加阳性对照标记PCR标记产物杂交结果，B为RABV的杂交结果，C为LBV的杂交 结果，D为MOKV的杂交结果，E为DUVV的杂交结果，F为EBLV-I的杂交结果，G为EBLV-2 的杂交结果，H为ABLV的杂交结果。图4本发明所述Lv诊断与分型芯片的灵敏度试验结果；
图示Lv诊断与分型芯片灵敏度试验的FMedian532-B532的均值与含有目的基因的10 倍浓度梯度的标准质粒的对数值的线性关系图。图5本发明6个(A-F) 10倍浓度梯度的杂交图谱。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不违 背本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。实施例1 一、基因芯片制作
基因芯片制作材料包括光学级醛基修饰的玻璃基片、点样液、Lv的7个基因型特异 探针、对照探针和定位探针；
(1)光学级醛基修饰的玻璃基片和点样液；
晶芯光学级醛基基片，批号20091114 (博奥生物有限公司，北京)；晶芯基因芯片点样 液，批号=20090501 (博奥生物有限公司，北京)；
(2)Lv基因型特异探针设计与合成
设计探针根据GenBank数据库中登录的Lv各基因型全基因序列和N基因序列，利用 生物信息学软件Lasergene 7. 0分析获得每个型N基因的主序列，在位于Lv的N基因编码 区的55bp、99bp间(此区间7个基因型型间同源性较低，各型内部保守)设计寡核苷酸探 针，Tm值为65。C 75 °c。使用的探针设计软件为01 igo6. 0和Array designer 4.2。设计 好的探针在NCBI Nucleotide数据库中进行BLAST评价，剔除与目的基因相似性低于70%与非目的基因高于40%的探针。阳性对照探针为与目的基因同源型低的pGM-T载体序列设 计，阴性对照探针根据拟南芥的基因组设计SEQ ID广57。所有寡核苷酸探针5’端氨基化 修饰，由Bio Basic-DISTR公司合成。(3)点制芯片及点样后处理
寡核苷酸探针使用芯片点样液稀释成50ρπιΟ1/μ L，使用MicroGridII芯片点样仪将探 针通过机械针印迹于醛基修饰的玻璃基片上。点样矩阵为15行14列，每个点的直径大小 为130士20 μ m，点距为200 μ m，各型探针分布呈“时钟型”(附图1)。所述6条RABV探针点样位置为“时钟型“图谱的左上角位置(1点半钟指针方向)， 每条探针做一个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 1-6；
所述7条LBV探针点样位置为“时钟型“图谱的右中部位置(3点钟指针方向)，每条探 针做一个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 7-13；
所述8条MOKV探针点样位置为“时钟型”图谱的右下角部位(4点半钟指针方向)，除21 号探针做3次重复点样外，其余每条探针做一个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 14-21 ； 所述6条DUVV探针点样位置为“时钟型”图谱的下部(6点钟指针方向)，每条探针做一 个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 22-27 ；
所述6条EBLV-I探针点样位置为“时钟型”图谱的左下角部位(7点半钟指针方向)，每 条探针做一个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 28-33 ；
所述10条EBLV-2探针点样位置为“时钟型”图谱的左中部位(9点钟指针方向)，每条 探针做一个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 34-43;
所述7条ABLV探针点样位置为“时钟型”图谱的左上部位(10点半钟指针方向)，每条 探针做一个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 44-50 ；
所述3条质控探针点样位置为“时钟型”图谱的正上部(12点钟指针方向)，每条探针做 一个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 51-53 ；
所述3条阴性对照探针为“时钟型”图谱的正上部(12点钟指针方向)，位于质控探针下 面，每条探针做一个重复点样，探针序列分别为SEQ ID 54-56 ；
所述1条定位探针点样位置为“时钟型”图谱的四个角和中心四个点，8个重复点样点， 探针序列为SEQ ID 57 ；
点好的芯片水合固定2. 5h，室温避光干燥不少于36h，使用2%SDS洗涤，封闭液封闭甩 干后密封避光存于_20°C，至少可保存3个月。二、临床样品制备
按现有的技术(本发明人申请的，专利号ZL 2007 1 0056129. 4)提取样品的总RNA，并 使用可特异性扩增Lv的7个基因型的引物进行套式RT-PCR扩增，所不同的是本发明在内 套扩增时对上游引物5’端标记了 HEX绿色荧光基团。芯片阳性对照采用常规的PCR引物 荧光标记。所标记的PCR产物可直接用于后续操作，或低温避光保存，至少可保存1个月。三、芯片杂交
将PCR标记的样品和阳性质控对照样品加入含有99%甲酰胺、2 X SSC、1%SDS、 50XDenhart，S和DEPC水制备的杂交液中，配制成总体积为18ul的杂交混合液，95°C变性 5min，立即冰浴5min，迅速将混合液通过围栏盖片(购于博奥生物有限公司)加到芯片点阵 上，置于杂交湿盒中于42、5°C杂交不少于4h ；四、洗片及扫描
以终浓度为2XSSC、0. 2%SDS配制的洗液洗涤5min —次；终浓度为2X SSC洗配制的 洗液洗涤5min—次。瞬时离心甩干后，使用GenePix 4100A芯片扫描仪扫描，扫描参数设 置扫描单色激发光波长532nm，光电倍增管(PMT)值800，分辨率10 μ m。数据信号采集完 成后，结果保存为TIF格式的图像，以备后续分析。五、信号分析处理
使用GenePix Pro6. 0软件对采集的信号分析处理，参数设置为Blockl5 X 14矩阵，行 与列间距为200 μ m,点直径为130士20 μ m。手动对好点阵后，点击软件BCR分析按钮，即可 获得所有点阵的系列数据，包括信噪比(SNR)与绝对荧光中位值(F532Median-B532)等，利 用矩阵信息数据库可直接对结果判读。阳性探针点判定标准F532Median-B532 ^ 800，且 SNR ^ 1. 5 ；基因分型结果阳性标准为在对应型别区域出现大于等于2个阳性点即判定为 该型病毒。试验例1验证实施例制备的芯片能否达到检测和分型的用途
(1)样品预处理Lv组织样品以0.01mol/L的PBS研磨成10%w/v的组织悬液，待检；唾 液棉签拭子需倒置于离心管中，加入500 μ L样品稀释液，4°C静置2h，300(T5000rpm/min离 心lOmin。取上清，置于1. 5mL的离心管中，同时加入200 μ L的正常鼠脑组织类样品的研磨 液，混勻后，待检；
(2)按现有的技术(本发明人申请的，专利号ZL2007 1 0056129. 4)提取样品的总 RNA，并使用可特异性扩增Lv的7个基因型的引物进行套式RT-PCR扩增，不同之处为在内 套PCR扩增时使用5’端标记了 HEX绿色荧光素上游引物RVN371F。阳性对照PCR标记，取 0. 5 μ L 的 pGM-T 质粒加入预混体系10 X Extaq Buffer 5 μ L, dNTPs (25mM)2 μ L,上游引 物(5，HEX-TACCGCGAGACCCACGCTCA)2y L，下游引物(GACGCCGGGCAAGAGCAACT) 1 μ L，Ex-Taq 0. 5μ L，补水至 50μ L。PCR 循环程序均为-M0C 2min，然后 94。C 30s，56。C 30s，72。C 40s, 35个循环，最后72°C延伸lOmin。取5 μ L产物，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外凝胶成像仪 下观察结果。(4 ) Lv的7个基因型PCR扩增产物和芯片杂交分别取4 μ L的标记样品的 PCR产物和4 μ L标记的阳性质控对照样品与10 μ L杂交液(99%甲酰胺、1 X SSC、2%SDS、 50XDenhart' s和DEPC水各2 μ L)混勻后，于94°C变性6min，立即冰浴5min。等待期间， 通过芯片围栏粘贴工具将12样品围栏贴附于芯片上。冰浴完成后，通过芯片盖片将杂交 混合液加样于芯片围栏点阵中(注意不要触碰点阵，并保证点阵位于围栏中央)。杂交温度 43°C，杂交时间4小时。(5)芯片洗涤与扫描
以终浓度为0. 02XSSC、0. 02%SDS配制的洗液洗涤5min —次；终浓度为0. 02 X SSC洗 配制的洗液洗涤5min—次，2000转，2分钟离心甩干。使用GenePix 4100A扫描，参数设置 为光电倍增管(PMT) 800，单色荧光激发波长为532nm，分辨率10 μ m。扫描结束后，储存为 TIF格式的文档。基因分型结果阳性标准为当F532Median-B532彡800，且SNR彡1. 5为阳性点；在 对应型别区域出现大于或等于4个阳性点即判定为该型病毒；同时可结合杂交图谱判定。结果显示(图3)，仅加阳性质控对照样品的矩阵未出现其他探针点的杂交，对照成
8立；在加入Lv的广7基因型的PCR标记产物的矩阵区域分别出现了特异性的杂交结果。所 有的杂交点均满足阳性点的判定标准，基因分型结果与预期完全符合。试验例2 Lv检测分型芯片灵敏度试验
对浓度为61. Sng/ μ L的RABV标准质粒10倍梯度稀释，获6个梯度的稀释液。检测方 法参照试验例1。扫描结果保存为TIF格式图像。使用SPSS (版本13.0)对数据分析结果 统计学处理。结果显示(图4、图5)，本芯片能检测到最低浓度为6. 18X10_3ng/yL的Lv基因1 型cDNA的标准质粒。不同浓度梯度的质粒与所有杂交探针点的F532Median-B532的均值 呈较好的线性关系R2=O. 97。试验例3临床样品检测
使用本芯片检测本实验室2003年至2008年分离的33份阳性狂犬病临床样品，检测方 法参照试验例1。本芯片的检测结果显示，这些样品均为狂犬病阳性样品且均属于Lv基因1型，阳 性质控对照探针出现了特异的杂交，阴性对照成立，所有的样品阳性杂交点均符合阳性点 的判定标准，结果与预期符合。
权利要求
一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片，其特征在于包括了6条狂犬病病毒属基因1型探针，6条狂犬病病毒属基因2型探针，8条狂犬病病毒属基因3型探针，6条狂犬病病毒属基因4型探针，6条狂犬病病毒属基因5型探针，11条狂犬病病毒属基因6型探针，7条狂犬病病毒属基因7型探针，3条质控对照探针，3条阴性对照探针，1条定位探针，其中，所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片6条狂犬病病毒属基因1型(RABV)探针，其基因序列分别是SEQ ID 1 6;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片7条狂犬病病毒属基因2型(LBV)探针，其基因序列分别是SEQ ID 7 13;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片8条狂犬病病毒属基因3型(MOKV)探针，其基因序列分别是SEQ ID 14 21;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片6条狂犬病病毒属基因4型(DUVV)探针，其基因序列分别是SEQ ID 22 27;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片6条狂犬病病毒属基因5型(DUVV)探针，其基因序列分别是SEQ ID 28 33;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片10条狂犬病病毒属基因6型(EBLV 1)探针，其基因序列分别是SEQ ID 34 43;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片7条狂犬病病毒属基因7型(ABLV)探针，其基因序列分别是SEQ ID 44 50;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片3条质控对照探针，其基因序列分别是SEQ ID 51 53;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片3条阴性对照探针，其基因序列分别是SEQ ID 54 56;所述一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片1条定位探针，其基因序列是SEQ ID 57。
全文摘要
本发明公开一种狂犬病病毒属(lyssavirus,Lv)诊断与分型芯片及芯片制备方法，用于狂犬病病毒属诊断与分型的基因芯片(或寡核苷酸微阵列)，该方法可对临床样品中Lv的7个基因型同时进行检测和分型，具有快速、灵敏、特异性强、准确度高等特点。
文档编号C12Q1/68GK101921880SQ20101029632
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者席进, 涂长春 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所