一种猪伪狂犬病病毒变异株prv-zj01及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及猪伪狂犬病毒【技术领域】，特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo.8170。所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01在制备疫苗中的应用。采用PRV-ZJ01株病毒液制成水溶性灭活疫苗，与Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗进行猪体免疫保护试验，结果表明，ZJ01毒株灭活疫苗安全性较好，免疫保护效率明显高于Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗免疫组，Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗对ZJ01超强毒株不能提供完全保护。ZJ01灭活疫苗对PRV变异株和传统毒株均有较好免疫保护作用。PRV-ZJ01株106.0TCID50/mL滴鼻感染85日龄非免疫猪，可致全部发病和死亡。证明该病毒株毒力明显增强，抗原性发生变异，灭活后具有较好免疫原性，可用于该病疫苗和诊断方法研究与开发。
【专利说明】—种猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01及应用
[0001]【技术领域】
本发明涉及猪伪狂犬病毒【技术领域】，特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01，还涉及猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJOl的应用。
[0002]【背景技术】
伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科成员，可引起新生仔猪中枢神经系统紊乱，生长猪呼吸道症状，并能导致妊娠母猪流产、死胎与弱仔。美国与部分欧洲国家已宣布消灭和根除该病。我国广泛使用该病基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步净化。但是，自2011年底起，我国很多该病免疫猪场相继出现仔猪呕吐和神经症状、生长猪出现呼吸道症状，死亡率明显增高，妊娠母猪出现流产、死胎、弱仔等，造成严重经济损失，但对流行毒株的致病性和抗原性均不清楚。
[0003]
【发明内容】
为了解决以上现有技术中存在的疫情不能得到有效控制的问题，本发明提供了一种猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJOI。
[0004]本发明还提供了所述猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJOl在制备免疫疫苗的应用。
[0005]本发明是通过以下步骤得到的:
一种猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJOl，其保藏号为CGMCC N0.8170。采用IO6 qTCID5q滴鼻感染85日龄健康猪，非免疫猪全部发病和死亡。
[0006]所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJOl在制备疫苗中的应用。
[0007]优选所述疫苗为水溶性灭活疫苗。
[0008]疫苗的制备过程为:取PRV-ZJOl病毒液灭活，加入卡波姆佐剂混合均匀即得。病毒液中病毒含量为107_°TCID5(l/mL。
[0009]疫苗中病毒抗原含量大于106_°TCID5(l/mL。
[0010]本研究采集我国某发病猪群患病仔猪脑组织病料，无菌处理后接种BHK21细胞，盲传2代，培养2~3天出现明显细胞病变，病毒空斑纯化3次后连续传代15次，均出现相同病变，病毒TCID5tl为10_7_ 5/mL, PCR鉴定为PRV，命名为PRV-ZJOl毒株。病毒gE和gB基因序列测定结果显示其与其他已公布的毒株序列同源性分别为97.1%~99.6%和98.1%~99.5%，其gE基因推导的氨基酸序列在第54和448位发生D-1和V-1突变，第496位插入D。采用10头24日龄仔猪进行人工感染发病试验，结果显示，该分离株可引起PRV典型临床症状和病理变化，100%死亡。采用24头85日龄健康育肥猪滴鼻接种IO2 tlTCID5tl ^lO6 0 TCID50PRV-ZJOI株病毒液，结果为，攻毒组猪均出现发热，精神沉郁，呕吐，咳嗽，呼吸困难和神经症状等典型症状，106_° TCID5tl病毒感染组猪在攻毒后7天内全部死亡，病毒LD5tl为IO313TCID5(l/mL。该毒株与50份Bartha_K61、Bucharest、HB-98疫苗毒株血清及其抗血清交叉中和试验，结果显示，该分离毒株抗原发生明显变异，变异系数R值为0.378、.448，首次证明PRV-ZJOl毒株为PRV超强毒抗原变异毒株，属于血清2亚型超强毒株。
[0011]本发明的有益效果:采用PRV-ZJOl株病毒液(106_°TCID5(l/mL)制成水包油型灭活疫苗，与Bartha-K61活疫苗进行猪体免疫保护试验，结果表明，ZJOl毒株灭活疫苗安全性较好，免疫保护效率明显高于Bartha-K61活疫苗免疫组，Bartha-K61活疫苗对ZJOl超强毒株不能提供完全保护。证明该病毒株具有较好免疫原性，可用于该病疫苗和诊断方法研究与开发。
[0012]菌株保藏信息
保藏时间:2013年9月18日，
保藏单位:中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，
保藏编号:CGMCC N0.8170，
保藏单位地址:中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，
分类命名:猪伪狂犬病毒。
[0013]【专利附图】
【附图说明】 图1.PRV-ZJOl的分离与PCR鉴定，其中A为病毒感染BHK-21细胞形成的细胞病变；B为病毒感染BHK21细胞形成的空斑；C为分离病毒株PCR检测(1-4泳道为Fl，F5，FlO与F15代次病毒，第5泳道为细胞对照)。
[0014]图2.24日龄仔猪攻毒后不同时间仔猪死亡统计结果；
图3上两行图片为24日龄仔猪攻毒后死亡猪肉眼病变观察结果，下两行为24日龄仔猪攻毒后死亡猪病理组织学观察结果，其中，a为肝脏；b为脑；c为肺脏；d为脾脏；e为肾脏；f为淋巴结；
图4为24日龄仔猪攻毒后2周不同组织中PRV核酸定量检测结果；
图5为85日龄猪攻毒后不同时间猪死亡统计结果；
图6上两行为攻毒后死亡猪肉眼病变观察结果；下两行为攻毒后死亡猪病理组织学观察结果,其中a为肝脏；b为脑；c为肺脏；d为脾脏；e为肾脏；f为淋巴结；
图7为85日龄猪攻毒后2周不同组织中PRV核酸定量检测结果。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
实施例1
1.病毒分离与PCR鉴定
将采集的发病猪的脑组织剪碎混浆处理(组织与灭菌PBS重量体积比为1:10)，12000rpm离心10 min取上清经0.22 μ m滤器过滤用于病毒的分离。将ImL过滤的病料上清接种刚长满单层的BHK-21细胞，37°C孵育Ih后弃去培养瓶中液体并加入2% DMEM于含5%CO2的37°C细胞培养箱中培养，每天观察细胞是否出现病变。待70%细胞出现病变后，反复冻融3次，接种BHK21细胞。病毒空斑纯化3次，采用PRV PCR方法扩增gE基因，反应体系:1U AccuPrime? pfx DNA Polymerase 与2.5uL 10XAccuPrime? pfx Mix (Invitrogen),上下游引物各10 pmol, DNA模板IOOng,灭菌双蒸水补足50 μ L。PCR反应条件:951^预变性5 min ;95°C变性45s，62°C退火45s，68°C延伸3 min，上述3步骤进行35个循环；68°C后延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析。
[0016]结果为:病料组织无菌处理后接种长满单层的BHK-21细胞，20h后出现特征性细胞病变，表现为细胞变圆，折光性变强，形成形态各异的合胞体(图1A)，并可以形成空斑(图1B)。病毒经3次空斑纯化，连继传代15次，病毒TCID5tl为107 5/1111^0?检测？1，？5，？10与F15代细胞毒，均扩增出目的条带188bp(图1C)，证明该分离株属于PRV，毒株命名为ZJ01。
[0017]株基因序列测定与分析
采用PCR方法扩增gE与gB基因，反应体系同上。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析，回收目的片段，克隆至载体pEASYTM-Blunt Zero (TransGen)，进行基因测序分析。结果为:新分离毒株的这两个基因与其他已公布的PRV毒株序列同源性分别为97.1%~99.6%和98.1%~99.5%。基因进化树分析图中，新分离株位于一个相对独立的分支中。gE基因推导的氨基酸序列比对发现，新分离株与大多数毒株相比，在54与448位发生了 54位(D-1)与448 (V-1)突变，在第496位插入D。
[0018]日龄仔猪致病性试验
选择PRV阴性的24日龄仔猪10头，随机分成两组，每组5头，第I组每头猪滴鼻接种IO6 0 TCID50 PRV-ZJOl株病毒液(F5)，对照组滴鼻接种等量细胞营养液作为对照。隔离饲养，自由采食。每天观察实验猪发病症状(如精神萎靡，食欲不振，发热，神经症状，呼吸道症状与死亡等)，对死亡猪系统解剖后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结与脑组织冷冻保存，并将上述组织于4%多聚甲醛固定，制备组织切片，进行组织病理学检查，同时用荧光定量PCR方法检测各组中PRV核酸含量。见图2-4。
[0019]结果为:(I)仔猪攻毒后2天即出现发热(>41°C)，精神沉郁、呕吐、咳嗽、呼吸困难和神经症状等临床表现，所有 攻毒组仔猪在5天内全部死亡，而对照组全部健活，见图2。
(2)肉眼病变为:脾脏与肝脏表面出现白色坏色点，脑组织水肿，肺脏纹理增强，肾脏表面有出血点，淋巴结肿大出血。(3)组织病变为:肝细胞变性坏死，脾细胞坏死，肺脏间质性肺炎、上皮细胞坏死，肾脏出血，淋巴结坏死、出血，非化脓性脑炎(“卫星现象”，“噬神经元现象”且在高倍镜下可见病毒包涵体)。见图3，。(4)PRV DNA载量均在肺脏中最多，其次是脑组织，见图4。
[0020]日龄育肥猪致病性试验
选择PRV阴性的24头85日龄健康猪，随机分成6组，每组4头，其中第1-5组为攻毒组，每头猪分别滴鼻接种IO2 0TCID50~106_° TCID50 PRV-ZJOl株病毒液，第6组为对照组，滴鼻接种等量细胞营养液。自由采食，隔离饲养，观察2周，记录发病症状与死亡情况，按Reed-Muench法计算LD5tl。同时，取死亡猪和试验结束时猪，进行剖检，观察肉眼病变，并取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结与脑组织冷冻保存，并将上述组织于4%多聚甲醛固定，制备组织切片，进行组织病理学检查。同时，用荧光定量PCR方法检测各组中PRV核酸含量。见图5-7.结果为:攻毒组实验猪均出现发热(> 41°C )，精神沉郁，咳嗽，呼吸困难，神经症状与死亡等临床表现，IO6 ci TCID5tl病毒组在攻毒后7天内全部死亡，对照组全部健活。见图5。病毒对85日龄猪LD5tl为IO313 TCID5(l/mL。肉眼病变与24日龄攻毒仔猪相似，主要为:脾脏边缘出血，肝脏表面出现局灶性坏死，肾脏、淋巴结、肺脏与脑组织。组织病变为:肝细胞变性坏死，脾脏出血，肺脏间质性肺炎，肾脏出血，淋巴结坏死，非化脓性脑炎(“袖套现象”)。见图6.PRV DNA载量均在肺脏中最多，其次是脑组织。见图7。
[0021]病毒血清交叉中和试验
选择PRV阴性的30日龄健康猪50头，随机分成5组，每组10头，第I组肌肉注射IO20TCID50 PRV-ZJOl株病毒液，第2-5组按说明书分别接种4种PRV疫苗，即Bartha_K61清伪灵(LT 1205476，辉瑞)、Bartha-K61 (LT 20120602，武汉中博)、Bucharest 扑伪佳(LTA289184，辉瑞)、HB-98株(LT 121041，武汉科前)。免疫后4_5周采集血液，分离血清，抗血清56°C水浴30min灭活处理，用于病毒血清交叉中和试验。血清倍比稀释后分别与100TCID50原免疫病毒和ZJOl毒株混合，37°C孵育lh，每个血清稀释度设置4个重复。接种96孔板BHK-21细胞单层，100 μ L/孔，置5% CO2细胞培养箱37°C培养4d，于显微镜下观察细胞病变CPE，记录病变孔数目。按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。运用SPSS 16.0软件进行统计分析。并采用以下公式计算R值。结果见表1，
【权利要求】
1.一种猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJOl，其保藏号为CGMCC N0.8170。
2.—种权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJOl在制备疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述疫苗为水溶性灭活疫苗。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于疫苗的制备过程为:取含有PRV-ZJOl病毒的病毒液，灭活，加入佐剂混合均匀即得。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于病毒液中病毒含量为107_°TCID5(l/mL。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的应用，其特征在于疫苗中病毒抗原含量大于106°TCID5(l/mL。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的应用，其特征在于所述病毒液与佐剂的重量比为4:1。
8.根据权利要求4`-6中任一项所述的应用，其特征在于所述佐剂为卡波姆。
【文档编号】C12N7/00GK103627678SQ201310701688
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】姜平, 顾真庆, 白娟 申请人:姜平