一种抗狂犬病病毒特异性人源抗体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种抗狂犬病毒的中和性抗体，尤其是人源化或全人源单克隆抗体，以满足临床上诊断和/或治疗狂犬病的需要。本发明采用噬菌体抗体库技术，以接种过狂犬病疫苗的32份高效价的健康人外周血为原材料，制备噬菌体抗体库。该抗体库通过三轮筛选，获得7株ELISA阳性抗体。进一步通过RFFIT方法测定其中和活性，其中的R5、R7、R8、R9共四株具有较强的中和活性。本发明的具有高亲和力的人源化的抗狂犬病病毒抗体，可用于替代ERIG和HRIG，对于狂犬病毒严重暴露者进行主动和/或被动免疫治疗。
【专利说明】一种抗狂犬病病毒特异性人源抗体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒性疾病的预防和治疗，尤其涉及狂犬病的预防和治疗。
【背景技术】
[0002] 狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV)引起的世界性人兽共患传染病，人和 动物一旦发病死亡率高达100%。世界卫生组织（WHO)最新数据指出，全球每年约有55000 人死于狂犬病，主要集中在亚非拉发展中国家。WHO建议，对于严重暴露者应同时进行主动 和被动免疫治疗，以获得快速的保护作用。目前，用于被动免疫治疗的制剂主要有马抗狂犬 病病毒免疫球蛋白（equine rabies immune globulin, ERIG)和人抗狂犬病病毒免疫球蛋 白（human rabies inlmune globulin，HRIG)。然而，ERIG 和 HRIG 的供应量有限、价格偏 高，在狂犬病呈地方性流行的不发达地区应用难以普及，并且ERIG和HRIG也均存在可导致 过敏反应及传播血液性疾病等缺点。
[0003] 应用单克隆抗体技术开发抗狂犬病病毒特异性的McAb防治狂犬病可以克服多 抗血清的诸多缺点，临床应用前景广阔。国外Dietzschold B等利用经HDRV免疫的志愿 者外周血B淋巴细胞和鼠骨髓瘤SHM-D33细胞融合形成的杂交瘤细胞J57 (Dietzschold B，J Virol 1990 ;64(6) :3087.);相同方法制备杂交瘤 JA、JB(Champion JM, Dietzschold B，J Immunol Methods. 2000 ;235 (1-2) :81-90)。从杂交瘤 J57、JA 和 JB 中克隆扩增抗体 的重链、轻链序列，插入到重组棒状病毒载体（RhV)，经表达得到的抗体称为S057、S0JA、 S0JB(Morimoto K, Dietzschold B, J Immunol Methods. 2001 ;252 (1-2):199-206.)。S057、 S0JA和S0JB被组合成第一种鸡尾酒疗法组合物，用于和HRIG比较，评价对狂犬病毒PEP的 效果（Prosniak M, Dietzschold B, J Infect Dis. 2003 ; 188:53 - 56.)。Jones D 等进一步 将S057、S0JA和S0JB的重链可变区、轻链可变区克隆，插入到人IgGl表达载体，在人PER. C6细胞中表达，得到的抗体称为CR57、CRJA、CRJB(Jones D，et al.Biotechnol Prog，2003; 19 (1) : 163-8.)。在对CR57、CRJA、CRJB三抗体组合中的评价中，研究者发现CRJA保护潜 力弱，CR57、CRJB竞争性结合RV糖蛋白，并且发现存在对CR57和CRJB中和逃逸的病毒 株。此后Bakker AB等研究者构建了两个RV-免疫噬菌体文库，从中筛选出一株具有高亲 和力的，并且抗原表位与CR57不重叠的RV糖蛋白特异性抗体CR4098 (Bakker AB，et al. J Virol, 2005 ;79(14) :9062 - 8.)。CR57和CR4098的组合称为CL184,是进行临床评价的第 二种鸡尾酒疗法，目前由荷兰Crucell公司开发，在印度完成I期临床研究（Bakker AB，et al. Vaccine, 2008, 26(47):5922 - 5927.)。
[0004] 尽管已有部分抗狂犬病病毒特异性的McAb进入临床研究阶段的报道，但至今仍 没有药物被批准上市。因此，本领域迫切需要开发具有高亲和力的完全人源化的抗狂犬病 病毒抗体，用于替代ERIG和HRIG,已满足对于严重暴露者进行主动和被动免疫治疗的需 要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗狂犬病病毒的中和性抗体，尤其是人源化或全人源单 克隆抗体，以满足临床上诊断和/或治疗狂犬病的需要。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种人源抗狂犬病病毒中和性抗体，该中和性抗体的 重链可变区包含如下的互补决定区：
[0007] CDR1 ：GGSMRRSNYY,
[0008] CDR2 :IYYSGTT，
[0009] CDR3 ：ASESTVTAKLDN ；
[0010] 该中和性抗体的轻链可变区，包含下表中1-4组中的互补决定区中的一组：
[0011]
【权利要求】
1. 一种人源抗狂犬病病毒中和性抗体，其特征在于： 其重链⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列为： CDR1 :GGSMRRSNYY， CDR2 :IYYSGTT, CDR3 :ASESTVTAKLDN ; 其轻链⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列选自下表1-4组中的一组：
2. 如权利要求1的抗体，其特征在于： 所述的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3所示的 序列； 所述的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7所示的序列。
3. 如权利要求1的抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨 基酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 4所示。
4. 如权利要求1的抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨 基酸序列分别如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 5所示。
5. 如权利要求1的抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨 基酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 6所示。
6. 如权利要求1的抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨 基酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 7所示。
7. 如权利要求1-6中任一项的抗体，其特征在于，其为单链抗体ScFv、Fab或全分子免 疫球蛋白。
8. 编码权利要求1-6中任一项的抗体的基因序列。
9. 如权利要求8的基因序列，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列和轻链可变 区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 11所示。
10. 如权利要求8的基因序列，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列和轻链可变 区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 12所示。
11. 如权利要求8的基因序列，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列和轻链可变 区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 13所示。
12. 如权利要求8的基因序列，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列和轻链可变 区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 14所示。
13. 如权利要求1-6中任一项的抗体在制备预防或治疗狂犬病的药物中的应用。
14.如权利要求1-6中任一项的抗体的狂犬病毒检测试剂中的应用。
【文档编号】A61K39/42GK104193823SQ201410417957
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】毛晓燕, 陈继军, 安晨, 乔玉玲, 马瑞 申请人:兰州生物制品研究所有限责任公司