L， 充分混合后16°C连接8h。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，感受态细胞制备程序 为：1)挑取DH5 a单克隆菌落至ImL LB培养基中，37°C振荡培养过夜；2)吸取IOOyL过 夜培养菌液，接种于20mL的LB培养基中，37°C振荡培养3-6h至OD 6tltl为0. 3-0. 4左右；3) 将菌液冰浴降温，转移至I. 5mL的EP管中，4°C 4000g离心3min ;4)弃上清，加入ImL预冷 0· ImoVLCaCl2溶液悬浮沉淀，冰浴30min，4°C 4000g离心5min ;5)弃上清，加入40 μ L预 冷0. lmol/L CaCl2溶液，4°C放置12h后使用，转化效率可达到最高；每次可大量制备感受 态细胞，放置于_70°C保存待用。连接产物转化程序为：1)将40yL感受态细胞和5yL连 接产物（如果是质粒，只要2μ L)混合，4°C冰浴30min ;2) 42°C热休克90s，冰浴2min ;3) 加入360 μ L无抗性的LB培养液，37°C振荡培养45-60min ;4)吸取200 μ L上述菌液涂布于 具有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中。37°C培养12h，在选择培养液中挑取白色单克隆 菌落，接种于5mL LB培养液中培养过夜，吸取少量菌液保种，然后用PCR或碱裂解法少量提 取质粒DNA进行酶切鉴定，构建中间载体pET21a-CP (第一中间载体)，载体构建完成后测序 确认(上海英骏生物公司完成）；
[0049] (3)以MP-F和MP-R为引物，pMS27为模板（D. S. Pesbody教授惠赠)，扩增出噬菌 体成熟酶基因，预计扩增片段长度为1200bp左右，扩增体系为10XPCR bufferl.OyL， MP-F 和 MP-R (10 μ mol/L)均为 0· 5 μ L，dNTPO. 5 μ L，TaqDNA 聚合酶（5U/ μ L) 0· 3 μ L，质 粒pMS271. 0 μ L，超纯水补足总体积为20 μ L，反应程序为：94°C预变性5min ;然后94°C变 性45s，50°C退火45s，72°C延伸60s，共32个循环，最后72°C延伸8min，4°C保存，PCR产物 经1 %琼脂糖凝胶电泳确定目的条带。PCR扩增出的特异性片段，用BamHI和HindIII双酶 切，酶切体系为PCR产物20 μ L，10XK buffer4 μ L，BamHI和HindIII均为3 μ L，超纯水补 足至40 μ L体系，37°C酶切4h。酶切产物1%凝胶电泳分离后，紫外箱内切割目的条带。目 的条带的凝胶回收操作与上述步骤一致。同样的BamHI和HindIII双酶切方法酶切载体 pET21a-CP，酶切产物经过凝胶电泳分离、凝胶纯化回收凝胶回收操作与上述步骤一致，将 PCR扩增酶切纯化后条带与酶切纯化载体pET21a-CP连接，连接体系pET21a-CP载体片段 14 1^，1'40嫩连接酶14 1^，10\1'40嫩131^€61'14 1^0?目的片段7 4 1^，充分混合后161：连接 8h。连接产物转化DH5a感受态细胞，涂抗性平板，挑选阳性克隆，酶切鉴定后测序确认，序 列无误的命名为pET21a-CPMP载体(第二中间载体)。
[0050] (4)以Pac-F和Pac-R为引物，pMS27为模板（D. S. Pesbody教授惠赠)，扩增出噬菌 体包装位点基因片段，扩增体系为1〇\?〇?131^€61'1.(^1^3(34和？3(3-1?(1(^111〇1/1)均 为 0· 5 μ L，dNTPO. 5 μ L，TaqDNA 聚合酶（5U/ μ L) 0· 3 μ L，质粒 pMS271. 0 μ L，超纯水补足总 体积为20 μ L，反应程序为：94°C预变性5min ;然后94°C变性45s，52°C退火45s，72°C延伸 30s，共32个循环，最后72°C延伸8min，4°C保存，PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳确定目的 条带。扩增出的片段和载体pET21a-CPMP分别用HindIII和NotI双酶切，酶切体系为PCR 产物 20 μ L，IOXK buffer2 μ L，IOXBSA buffer4 μ L，HindIII 和 NotI 均为 3 μ L，超纯水 补足至40 μ L体系，37°C酶切4h。酶切产物1%凝胶电泳分离后，紫外箱内切割目的条带。 目的条带的凝胶回收操作与上述步骤一致。双酶切回收的两种产物进行连接，连接体系为 pET2Ia-CPMP载体片段 1 μ L，T4DNA连接酶 1 μ L，IOXT4DNA buffer 1 μ L，PCR 目的片段 7 μ L， 充分混合后16°C连接8h。连接产物转化DH5 α感受态细胞，涂抗性平板，挑选阳性克隆，酶 切鉴定后测序确认，序列无误的命名为pET21a-CMPc载体(重组载体)，该载体中基因的排列 顺序如图1。
[0051] 实施例2:
[0052] pET2Ia-CMPc载体及对照载体pCPES表达及PEG纯化：
[0053] 将实施例1测序正确的原核表达载体pET21a_CMPc和原核表达载体pCPES分别转 化表达菌株BL21 (DE3)，鉴定为阳性的克隆分别接种于加有氨苄青霉素的抗性LB培养基 中，均振荡培养至OD6tltl = 0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，诱导基因表达。诱 导条件均设定为：温度37°C，转速为160r/min，诱导4h。诱导结束后分别离心收集两种菌 体细胞，各加入1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体至溶液清亮，然 后12000r/min离心15min，取上清液，用0. 22 μ m滤膜过滤，滤液中溶解有大量原核表达出 的MS2噬菌体假病毒颗粒。分别从两种滤液中吸取20 μ L，加入20 μ LI X蛋白上样缓冲液， 100°C沸水中煮沸5min，分别取10 μ L进行SDS-PAGE电泳。两种表达载体pET21a-CMPc和 pCPES外壳蛋白表达量的比较均通过SDS-PAGE电泳后，观察凝胶上外壳蛋白条带的亮度差 异进行比较，条带粗的表达量大，条带弱的表达量小。如图2所示，实验结果表明本研究构 建的表达载体pET21a-CMPc目的基因外壳蛋白的表达量远远大于传统载体的构建方式构 建的pCPES载体。
[0054] 实施例3
[0055] 病毒样颗粒的纯化：
[0056] 纯化采用PEG沉淀噬菌体颗粒的步骤（Joseph Sambrook, Russell David W.著， 黄培堂等译。分子克隆实验指南[Μ]。第三版。北京：科学出版社，2002,186-187)，并稍微 修改进行纯化
[0057] (1)将实施例2中超声波破碎过滤液放入37°C水浴中8h，利用细菌细胞自身的核 酸酶消化过滤液中残存的RNA和DNA，病毒样颗粒因为具有耐RNase的特性，所以外壳蛋白 包裹的RNA不被消化。
[0058] (2)加固体NaCl至浓度为lmol/L，冰浴lh。（加 NaCl可以促使病毒样颗粒与细菌 碎片分离，也是从聚乙二醇中有效沉淀病毒样颗粒所必需的。4°C 12000r/min离心lOmin， 以除去细菌碎片，将上清液转移到另一干净的离心管中。
[0059] (3)加固体聚乙二醇PEG8000至终浓度为10% (W/V)，室温搅拌使其完全溶解，冰 浴Ih以使病毒样颗粒形成沉淀。
[0060] (4) 4? 12000r/min离心IOmin,回收沉淀的病毒样颗粒，弃去上清并用纸吸去残 存的液体。
[0061] (5)加适量的水到沉淀中，用枪头不停吸打使其充分混匀。然后加入等体积的氯仿 振荡30s，以除去病毒样颗粒悬液里的聚乙二醇和细菌碎片。
[0062] (6) 4°C 5000r/min离心15min，分离有机相和水相，回收含病毒样颗粒的水相，即 为纯化的病毒样颗粒，可以将得到的产物用PBS充分透稀，利用冷冻干燥进行假病毒颗粒 溶液的浓缩。
[0063] 实施例4
[0064] 电镜观察原核表达的融合蛋白：
[0065] 分别取10 μ L实施例3中纯化的假病毒颗粒样品加在铜网的碳膜上，经2 %的磷钨 酸染色5min，自然干燥2h。用JEM2100透射电子显微镜观察原核表达重组蛋白自主包装成 的VLP颗粒，电镜观察结果见图3,透射电子显微镜下观察到表达的MS 2假病毒颗粒成圆形 颗粒形状，大小25nm左右。
[0066] 实施例5
[0067] 病毒样颗粒的双酶消化实验：
[0068] 分别取4份20 μ L的实施例3中纯化的假病毒颗粒：第一份不加酶，第二份加2U DNase I，第三份加 IOOU RNaseA，第四份加 IOOU RNaseA和2U DNase I。放于37°C水浴锅 中保温lh，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测病毒样颗粒对核酸酶的耐受能力。结果表明所表达 的假病毒颗粒对核酸酶有很好的耐受作用，能有效保护其内部包裹的RNA片段不受核酸酶 的影响，两种酶作用Ih后，琼脂糖凝胶上仍然能清楚观察到内部包裹的RNA的清晰条带（图 4)。
[0069] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即 依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1)合成下列引物： CP-F ： 5; -GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3; CP-R ： 5; -GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3; MP-F ： 5; -GCGGATCCTCCTAGGAGGTTTGACCTGT-3; MP-R ： 5; -GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3; Pac-F ： 5; -GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG-3; Pac-R:5, -CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3,; (2 )用引物CP-F和CP-R通过PCR扩增出MS2噬菌体的外壳蛋白基因序列；用引物MP-F 和MP-R通过PCR扩增出MS2噬菌体的成熟酶基因序列；用引物Pac-F和Pac-R通过PCR扩 增出MS 2噬菌体的包装位点基因序列； (3) 将上述外壳蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包装位点基因序列依次连接到没有 引导肽序列的原核表达载体中，得到重组载体； (4) 将重组载体转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，再依次收集菌体、破碎菌体、离心、取上 清液、过滤及纯化，即得所述MS2假病毒颗粒。
2. 如权利要求1所述的一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法，其特征在于：所 述步骤（3)具体包括如下步骤： a、 对所述没有引导肽序列的原核表达载体和上述外壳蛋白基因序列用NheI和BamHI 双酶切，再连接形成第一中间载体； b、 对上述第一中间载体和上述成熟酶基因序列用BamHI和HindIII双酶切，再连接形 成第二中间载体； c、 对上述第二中间载体和上述包装位点基因序列用HindIII和NotI双酶切，再连接形 成所述重组载体。
3. 如权利要求1所述的一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法，其特征在于：所 述没有引导肽序列的原核表达载体为pET21a。
4. 如权利要求1所述的一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法，其特征在于：所 述步骤（4)的大肠杆菌为BL21。
5. 如权利要求1所述的一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法，其特征在于：所 述步骤（2)的PCR的模板为pMS 27。
【专利摘要】本发明公开了一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法，该方法将MS2噬菌体外壳蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包装位点基因序列依次连接到没有引导肽序列的原核表达载体中，得到重组载体，该重组载体能够在大肠杆菌中表达MS2噬菌体假病毒颗粒，且具有很高的表达量。
【IPC分类】C12R1-92, C12N15-70, C12N7-04
【公开号】CN104560896
【申请号】CN201310576430
【发明人】张国广, 邹金美, 罗开梅, 张泽宏
【申请人】闽南师范大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年11月15日