一种碱性木聚糖酶的高密度发酵生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种发酵生产碱性木聚糖酶的方法，尤其是一种海洋微生物发酵生产碱性木聚糖酶的方法。
【背景技术】
[0002]木聚糖广泛存在于自然界，其含量仅次于纤维素，约占植物干重的15-30%，木聚糖酶由木糖经糖苷键链接形成主链，并且由阿拉伯糖、乙酰基、葡萄糖醛酸、干楼堂等复杂侧链组成。因此，木聚糖酶具有十分重要的工业应用价值，在饲料、纺织、食品、造纸以及生物能源行业具有重要的应用价值。碱性木聚糖酶能够应用于造纸行业处理纸浆，降低漂白时候氯的用量，减少了环境污染的风险。
[0003]嗜盐菌Gracilibacillus imrinus 一种中度嗜盐菌，其最佳生长pH为8.5,生长需要氯化钠的存在，生长范围为l_20%Nacl，我们实验证明，在木聚糖诱导的条件下其能够包内产生碱性木聚糖酶。
[0004]但目前木聚糖酶多为酸性木聚糖酶，有少数产碱性木聚糖酶也存在着一定的问题,例如产量不高,并且由于细菌产木聚糖酶为胞内酶,需要破碎细胞也是影响木聚糖酶生产的一个主要问题，因此，开发高效生产碱性木聚糖酶的发酵生产方法对工业应用具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种通过海洋微生物发酵生产碱性木聚糖酶的方法。
[0006]本发明利用嗜盐菌来生产碱性木聚糖酶，相比其他生产方法，其中优点是破壁容易，由于嗜盐菌细胞释放到淡水中的时候，渗透压的改变造成细菌破壁死亡，胞内物质就释放到溶液当中。本方法生产碱性木聚糖酶工艺较为简单，成本较低。
[0007]实现本发明目的的一种通过海洋微生物发酵生产碱性木聚糖酶的方法，包括以下步骤。
[0008](I)将能够产四氢嘧啶羟化酶的海洋微生物菌种接种在试管中活化18_26h，然后接种到摇瓶中扩大培养。
[0009](2)将摇瓶中的菌种接种到种子罐扩大培养，接种量为3-8%，然后种子罐培养20-24h后以5-10%的接种量接入发酵罐发酵。
[0010](3)发酵罐发酵过程中流加木聚糖和氯化铵作为碳氮源，发酵28-36小时后海洋微生物产酶结束。
[0011](4)将发酵液离心收集细胞然后将收集到的湿细胞加入为其20倍的水中释放2-10分钟，然后离心，收集液体，即为粗酶液，根据用途将粗酶液进一步纯化分离结晶。
[0012]实现本发明所用的海洋微生物为来自德国菌种保藏中心的Gracilibacillusmarinus DSM 23372τ。【具体实施方式】
[0013] 实施例1
(1)菌种活化，选用德国菌种保藏中心的/feJofflmasdoflgaieDSM2581τ作为发酵菌种，选用营养培养基作为试管和三角瓶培养的活化培养基，比例如下(g/L):5g酵母膏，5g蛋白胨，0.5M NaCl, pH调整到8.5。试管装液量6ml，500ml锥形瓶装液量10ml ；
(2)发酵培养基(g/L)，麸皮10g，玉米粉5g，豆柏粉，10g，木聚糖lg，硫酸镁0.0lg,硫酸亚铁，0.005g，2M NaCl，pH调整到8.5;
(3)将保存于-80度冰箱的种子取出到试管中活化20h，240转/秒摇床培养。然后接种于锥形瓶中，240转/秒摇床摇瓶培养24h ；
(4)将摇瓶培养的种子接入35升种子罐发酵培养基中，培养20h后接种到300升发酵培养基中发酵36h，发酵过程中流加木聚糖和氯化铵作为碳氮源；
(5)将步骤四得到的发酵液通过高速离心机10000转离心收集菌体，然后将菌体置入储藏罐加入20倍水，搅拌2-5分钟，离心收集液体即为粗酶液。粗酶液通过硫酸铵沉淀收集，然后进一步纯化为目的酶制剂。
【主权项】
1.一种碱性木聚糖酶的高密度发酵方法，包括以下步骤: (1)将能够产四氢嘧啶羟化酶的海洋微生物菌种接种在试管中活化18-26h，然后接种到摇瓶中扩大培养； (2)将摇瓶中的菌种接种到种子罐扩大培养,接种量为3-3%，然后种子罐培养20-24h后以5-10%的接种量接入发酵罐发酵； (3)发酵罐发酵20小时后将发酵罐的培养基中盐浓度提高到23%，然后持续发酵10-15小时，然后海洋微生物产酶结束； (4)将发酵液离心收集细胞然后将收集到的湿细胞加入为其20倍的水中释放2-10分钟，然后离心，收集液体，即为粗酶液，根据用途将粗酶液进一步纯化分离结晶。
2.根据权利要求1所述的一种海洋微生物发酵生产碱性木聚糖酶的方法，其特征在于:所述海洋微生物为能够产碱性木聚糖酶的嗜盐菌Greicilibeicillus marinus。
【专利摘要】本发明提供一种从海洋微生物中经过高密度发酵生产碱性木聚糖酶的方法，将能够产碱性木聚糖酶的海洋微生物菌种活化，然后经过摇瓶扩大，以3-5%的接种量接到种子罐，然后以5-10%的接种量从种子罐接种到发酵罐中高密度发酵，发酵过程中流加木聚糖糖和氯化铵作为碳氮源，持续发酵28-36h，发酵液通过高速离心机收集菌体细胞，然后将离心收集到的湿细胞加入重量为其20倍的水中释放2-10分钟，然后离心，收集液体，即为粗酶液。然后根据需要进一步纯化制备成不同纯度和活性的酶制剂。
【IPC分类】C12R1-01, C12N9-42
【公开号】CN104560915
【申请号】CN201310472081
【发明人】朱道辰, 陈焱, 朱淑静, 洪好
【申请人】镇江拜因诺生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月11日