NH4) #04饱和溶液至体系中硫酸铵的饱和度为80%，缓慢搅拌Ih后4°C静置2h，IOOOOg离 心IOmin,收集沉淀，得到粗蛋白。将粗蛋白复溶于20mmol .171 Tris-HCl (pH 7. 2)缓冲 液中，充分透析除盐后，透析液用Amicon? ultra-15 (3K)超滤离心管浓缩。
[0037] (4)层析法获得鼠妇纤溶酶 ①Sephadex G-100凝胶过滤层析：Sephadex G-100凝胶过滤柱用4个柱体积的洗脱 缓冲液 I (pH 7. 2、20 mmol · Γ1 的 Tris-HCl 缓冲液）平衡，流速为 I. 0 ml · min ' 取 2ml 经透析和浓缩后的粗蛋白溶液，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤后缓慢加入到层析柱顶部进行凝 胶层析法分离。用洗脱缓冲液I进行洗脱，流速不变，每4mL为一管收集洗脱液，测定各管 洗脱液在280nm处吸光度和纤溶活性(溶栓活性)，将具有纤溶活性的洗脱液收集起来，用 Amicon? ultra-15 (3K)超滤离心管浓缩，得到活性蛋白提取物I。
[0038] ②Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析：Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱用4个 柱体积的洗脱缓冲液I (成分同上）平衡，流速为〇. 5 ml min'将活性蛋白提取物I缓慢 加入到Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱顶部进行凝胶层析法分离。采用洗脱缓冲液I以 0. 5 ml · mirT1进行洗脱，每3mL为一管收集洗脱液，测定各管洗脱液在280nm处吸光度和 纤溶活性，将具有纤溶的洗脱液收集起来，用Amicon? ultra-15 (3K)超滤离心管浓缩，得 到活性蛋白提取物II。
[0039] ③HiTrap Capto Q阴离子交换层析：HiTrap Capto Q阴离子交换层析柱用10个 柱体积的平衡缓冲液III(pH8.0、20 mmol Tris-HCl缓冲液）进行平衡，平衡缓冲液III的 流速为I. 〇 ml · mirT1。将活性蛋白提取物II缓慢加入到HiTrap Capto Q阴离子交换层 析柱顶部，先用平衡缓冲液III洗脱未吸附的蛋白，洗脱至基线后，采用平衡缓冲液III和洗脱 缓冲液III (ρΗ8· 0, 20m mol · Γ1 Tris-HCl缓冲液中添加有终浓度为I mol · L-1NaCl)进行 阶段洗脱，第一阶段洗脱缓冲液III的体积百分比为20%，第二阶段洗脱缓冲液III的体积百分 比为30%，第三阶段洗脱缓冲液III的体积百分比为40%，第四阶段缓冲液III的体积百分比为 50%。阶段洗脱后再进行梯度洗脱，没有蛋白活性峰出现。洗脱过程中的流速保持ImPmin' 每一阶段洗脱至洗脱峰结束时切换至下一阶段洗脱。每2mL为一管收集洗脱液。测定各 管洗脱液在280nm处的吸光度和纤溶活性，将具有纤溶活性的洗脱液收集起来，用Amicon? ultra-15 (3K)超滤离心管浓缩，得到活性蛋白提取物III。
[0040] ④Superose-12凝胶过滤层析：Superose_12凝胶过滤柱用3个柱体积的洗脱缓 冲液I进行平衡，流速为1. 〇 ml · mirT1;将活性蛋白提取物III缓慢加入到Superose-12 凝胶过滤柱顶部进行凝胶层析法分离。用洗脱缓冲液I进行洗脱，流速不变，每3mL为一管 收集洗脱液，检测各管蛋白液在280nm处吸光度和溶栓活性，将具有溶栓活性的洗脱液收 集起来，用Amicon? ultra-15 (3K)超滤离心管浓缩，之后用Zeba脱盐离心柱脱盐，冷冻干 燥即得到鼠妇纤溶酶，将其命名为PSLTroO 1。
[0041] 实施例2.鼠妇纤溶酶PSLTroOl的纯化结果 采用实施例1中方法纯化的结果如图1-4所示。其中Sephadex G-100凝胶过滤柱的 分离范围为2 kDa-120 kDa，色谱图如图1所示，洗脱过程出现了一个大的洗脱峰和较长的 肩峰，具有溶栓活性的蛋白先于其他组分流出色谱柱，提示具有溶栓活性的蛋白分子量可 能大于10 kDa。图2显示了 Sephacryl s-200 HR凝胶过滤柱的色谱图，出现2个主要的并 列的峰，具有溶栓活性的蛋白主要集中在第2个洗脱峰的前段。在HiTrap Capto Q离子交 换层析柱洗脱过程中，共有5个不同的蛋白洗脱峰，穿透峰、低盐洗脱(洗脱液中NaCl浓度 为0. 2 mol · Γ1和0. 3 mol · L 4 )及高盐洗脱(洗脱液中NaCl浓度为0. 5 mol · Γ1和I. 0 mol NaCl)的得到峰组分均无溶栓活性，其活性检测结果显示具有溶栓活性的蛋白为第 4个洗脱峰(洗脱液中NaCl浓度为0. 4 mol吨4)。在Superose-12凝胶过滤层析的色谱图 (图4)中，只有一个明显的洗脱峰，该洗脱峰的组分也同时表现出了明显的溶栓活性。
[0042] 纯化的具体结果见表1，本发明从蛋白量为1867. 2 mg的提取液中分离纯化得到 0· 36 mg鼠妇纤溶酶PSLTroOl，单位纤溶活力为1471. 9 Uint .mg-1,回收率为6. 7%，纯化倍 数为342. 3。
[0043] 表1.鼠妇纤溶酶的纯化结果
【主权项】
1. 一种鼠妇纤溶酶，其特征在于所述鼠妇纤溶酶具有溶栓和抗凝活性，采用如下方法 制备： (1) 将鼠妇采用湿法超微粉碎，获得提取液； (2) 从所述提取液中提取分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分； (3) 对步骤（2)所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分采用硫酸铵沉淀法进行纯化，获 得粗蛋白； (4) 将所述粗蛋白经凝胶过滤层析和阴离子交换层析，取具有溶栓活性的洗脱液，得到 鼠妇纤溶酶。
2. 根据权利要求1所述鼠妇纤溶酶，其特征在于步骤（1)中将鼠妇用6~10倍质量的水 浸泡0. 5~2 h，然后加入超微粉碎机中进行湿法超微粉碎。
3. 根据权利要求2所述鼠妇纤溶酶，其特征在于所述湿法超微粉碎的温度为0-40°C， 时间为5~30 min。
4. 根据权利要求2或3所述鼠妇纤溶酶，其特征在于步骤（2)中将所述提取液采用截 留分子量为80kDa~100kDa的中空纤维膜进行分离，取透过液，采用截留分子量为4kDa的中 空纤维膜进行分离，取截留液，得到分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分。
5. 根据权利要求4所述鼠妇纤溶酶，其特征在于步骤（3)中所述硫酸铵沉淀法具体为： 在所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心， 取沉淀，得到粗蛋白。
6. 根据权利要求5所述鼠妇纤溶酶，其特征在于所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组 分中先加入硫酸铵至饱和度为35-65%,静置后离心,取上清液；然后在所述上清液中加入 硫酸铵至饱和度为75-85%,静置后离心,取沉淀,得到粗蛋白。
7. 根据权利要求6所述鼠妇纤溶酶，其特征在于所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组 分中先加入硫酸铵至饱和度为55-65%,静置后离心,取上清液；然后在所述上清液中加入 硫酸铵至饱和度为75-85%,静置后离心,取沉淀,得到粗蛋白。
8. 根据权利要求5或6或7所述鼠妇纤溶酶，其特征在于步骤（4)的具体方法为：所 述粗蛋白依次经过Sephadex G-100凝胶过滤柱、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱、HiTrap Capto Q离子交换层析柱和Superose-12凝胶过滤柱，取具有溶栓活性的洗脱液，得到鼠妇 纤溶酶。
9. 根据权利要求8所述鼠妇纤溶酶，其特征在于所述鼠妇纤溶酶的分子量为 37. 5-38. 5KDa，且自N端起第1-15位氨基酸残基的序列为：Asp - lie - Asn - Gly - Gly -Gly - Ala - Thr - Leu - Pro - Gln - Pro - Leu - Tyr - Gln0
10. 权利要求1-9之一所述鼠妇纤溶酶在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种鼠妇纤溶酶及其应用，涉及制药领域。所述鼠妇纤溶酶，具有溶栓和抗凝活性，采用如下方法制备：（1）将鼠妇采用湿法超微粉碎，获得提取液；（2）从所述提取液中提取分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分；（3）对步骤（2）所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分采用硫酸铵沉淀法进行纯化，获得粗蛋白；（4）将所述粗蛋白经凝胶过滤层析和阴离子交换层析，取具有溶栓活性的洗脱液，得到鼠妇纤溶酶。发明首次发现了鼠妇纤溶酶PSLTro01，同时具有较强的溶栓和抗凝的活性，溶栓作用相对温和，可以用于制备治疗血栓性疾病药物。
【IPC分类】A61K38-48, C12N9-68, A61P7-02
【公开号】CN104560924
【申请号】CN201510043911
【发明人】李博, 吴勉华, 郭立玮, 田周
【申请人】南京中医药大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月28日