一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域，设计药用胰蛋白酶的生化分离技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取胰蛋白酶。
【背景技术】
[0002]胰蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它主要的功用有:能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
[0003]用传统的方法仅提取胰蛋白酶是相当困难的。2006年7月上海阿敏制药有限公司公开了一种糜胰蛋白酶的制备方法(200610023582.0)，其采用低温酸提、梯度盐析、冰水透析、亲和层析、乙醇醇析的产品工艺，得到糜胰蛋白酶。2011年I月马忠仁等申请了一种提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682.X)，其采用了 CaC12激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时加入饱和度的(NH4)2S04，使其生成硫酸钙沉淀吸附糜胰蛋白酶，经过洗脱、盐析、超滤和冻干获得白色的糜胰蛋白酶的冻干粉末。产品均为糜胰蛋白酶，没有单纯的胰蛋白酶提取分离纯化。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了生产高质量的胰蛋白酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，提供了一种提取胰蛋白酶方法。
[0005]本发明的技术方案是:利用硫酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理，调节PH，硫酸铵分级盐溶、盐析将胰蛋白酶原等沉淀析出，再将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干的方法，即可得较高纯度的胰蛋白酶，包括如下步骤:
1、胰蛋白酶粗制生产操作:
(1)提取工序:将新鲜的胰脏绞碎成胰浆，称重。按每千克胰浆加入2~3L的
0.1-0.2mol/L硫酸溶液，浸渍20~28小时，将浸渍物置滤袋过滤，滤干后弃去滤渣，留取滤液；
(2)盐溶工序:浸渍液中加入硫酸铵，达到30~50%饱和度，静置10~16小时，过滤，留取滤液；
(3)盐析工序:滤液中加入硫酸铵，达到50~80%饱和度，静置10~16小时，过滤，留取滤饼；
(4)每克滤饼加入2~5ml的水溶解，重复上述(2)、(3)操作；
(5)每克滤饼用l~3ml的水溶解，然后每克滤饼中加入0.1-1ml的饱和硫酸钱溶液，调节 pH 至 4.0-6.0 ； (6)结晶工序:溶液在20~30°C温度中静置24~72小时，有针状糜蛋白酶结晶析出；离心，调节pH至2.0-5.0，每100ml溶液中加300~400g固体硫酸铵，达到50~80%饱和度，静置12~16小时，抽滤；
(7)干燥工序:取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶粗品。
[0006]2、胰蛋白酶精制生产操作:
(O投料:称取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2?4ml的水搅拌溶解，调节pH至3.0 + 0.5，以助其溶解，搅拌10?16小时;计量溶液体积，按400?500g/L比例加入固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10?16小时；
(2)盐溶:将溶液过滤，称量滤饼重量，先按每克滤饼加入2~4ml的水，搅拌溶解后，调节pH至3.0±0.4，再按每克滤饼加入I?3ml的饱和硫酸铵溶液静止沉淀10?16小时；
(3)盐析:将溶液过滤，量取滤液体积，加入等体积量的饱和硫酸铵溶液，静置沉淀10?16小时；
(4)洗镁:将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置I分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重，待活化；
(5)活化:称滤饼重量为A千克，将滤饼溶于3A?5A升的0.001?0.01mol/L盐酸溶液，另加入0.5?2mol/L氯化钙溶液A?3A升及pH7.5?8.5硼酸缓冲液4A?6A升，再加入6A?9A升的水，调节pH至7.0?8.0，最后每克滤饼加5?15mg的结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液置O?10°C中静置60?80小时进行活化，pH控制在7.0?8.0 ;
(6)除钙:活化后的溶液，调节pH至3.0 ±0.4，再按200?300g/L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在O?10°C中存放32?60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液按150?250g/L加入固体硫酸铵，在O?10°C中静置10?14小时，过滤，得滤饼；
(7)结晶:按每克滤饼加入I?2mlpH8.0?10.0硼酸缓冲液，调节pH至8.0±0.4，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，O?10°C时浸于外透液中，结晶3?7天；
(8)透析:取出结晶液过滤得结晶物，再按每克结晶物加入I?3ml水溶解，调节pH至3.0±0.5 ;将溶液透析2?4天，去除杂质，每10?14小时左右透析池换水一次，温度控制在O?10°C ；
(9)冻干:取出透析液，加入少量硅藻土，抽滤，得滤液，调节pH至6.0±0.4，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品。
[0007]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
本发明采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取胰蛋白酶，通过对传统工艺的改进和创新，不仅生产出了高质量的胰蛋白酶，同时又具有简单、低成本等优点。
[0008]本发明已建立起一套规模化的生产工艺，制备的胰蛋白酶精品效价高达2500单位/毫克以上，符合《中国药典》(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。
【具体实施方式】
[0009]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0010]实施例1
1、胰蛋白酶粗制生产操作:
1.提取工序: 1.1新鲜的胰脏，用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重15Kg ;
1.2绞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液30L浸渍24小时，在浸渍期中每小时搅拌I次；
1.3将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再用0.125mol/L硫酸溶液15L浸渍I小时，滤干后弃去滤渣；
2.盐溶、盐析工序:
2.1将两次浸渍液合并，体积为44.9L，置塑料桶中，每100ml溶液中加入固体硫酸铵242g，达到40%饱和度，共加10.866Kg固体硫酸铵，静置12小时；
2.2过滤，留取过滤液，滤液体积为44L，固体弃去；
2.3在每100ml清液中加入固体硫酸铵205g，达到70%饱和度，共用硫酸铵9.020kg，静置12小时；
2.4过滤，留取滤饼，称重269.2g，弃滤液；
2.5用807.6ml水溶解，再按2.1、2.2、2.3、2.4步骤分次加固体硫酸铵近40%和70%饱和度沉淀；
2.6取70%饱和度沉淀物，称重178.5g，用267.8ml水溶解，加入89.3ml饱和硫酸铵溶液，并用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.00 ;
2.7将溶液静置25°C恒温箱中48小时，有针状的糜蛋白酶粗品结晶析出；
2.8过滤，母液用0.25mol/L硫酸调节pH至3.0，其体积为328.4ml加入硫酸铵100.8g，静置12小时；
3.干燥工序:
取沉淀物，置真空干燥箱内干燥，即得胰蛋白酶粗品，称重100.0g,即每千克胰脏可得6.67克胰蛋白酶.2、胰蛋白酶精制生产操作:
1.投料
1.1称取胰蛋白酶粗品100.0g,先用300ml纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.0，以助其溶解，搅拌12小时；
1.2计量溶液体积298.4ml，加入固体硫酸铵140.9g，待其溶解后，静置沉淀12小时；
1.3将溶液真空过滤，称量滤饼重量96.6g，加纯化水289.9ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调节PH至3.0，加入饱和硫酸铵溶液193.2ml，静止沉淀12小时；
1.4将溶液过滤，量取滤液体积479.3ml，加入饱和硫酸铵溶液479.3ml，静置沉淀12小时；
1.5洗镁:将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置I分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重93.3g，待活化；
2.活化
将滤饼溶于373.2ml0.005mol/L盐酸溶液，另加入lmol/L氯化钙溶液186.6ml及ρΗ8.0硼酸缓冲液466.5ml，再加入746.4ml纯化水，调节pH至7.4，最后加933mg活力较高的结晶胰蛋白酶进行活化处理，将溶液在5?10°C中静置72小时进行活化，第二天测pH值为7.4 ； 3.除钙
活化后的溶液用2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.1，溶液体积为1873ml，再加入固体硫酸铵455.2g，搅拌溶解，在O?10°C中存放48小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液加入固体硫酸铵369.0g，在O?10°C静置12小时，过滤，得滤饼重量45.6g ；
4.结晶
滤饼加入pH9.0硼酸缓冲液68.4ml，用2.5mol/L硫酸溶液调节pH至8.0，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，5?10°C浸于外透液中，结晶5天，每2小时摇包一次；
5.透析
取出结晶液过滤得结晶物28.1g,加纯化水43.1ml溶解，用2.5mol/L硫酸调节pH至
3.0 ;将溶液装透析袋，然后挂于透析池中透析3天，去除盐类杂质，每12小时左右透析池换水一次，温度控制在5?10°C ;
6.冻干
取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽滤，得滤液，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品6.2g，经测定其活性效价为2600iu/mg ;
实施例2
1、胰蛋白酶粗制生产操作:
1.提取工序:
1.1新鲜的胰脏，用镊子