和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重1Kg;
1.2绞碎物置塑料桶中，用0.150mol/L硫酸溶液25L浸渍24小时，在浸渍期中每小时搅拌I次；
1.3将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再用0.150mol/L硫酸溶液12.5L浸渍I小时，滤干后弃去滤渣；
2.盐溶、盐析工序:
2.1将两次浸渍液合并，体积为37.4L，置塑料桶中，每100ml溶液中加入固体硫酸铵225g，达到35%饱和度，共加8.415Kg固体硫酸铵，静置12小时；
2.2过滤，留取过滤液，滤液体积为36.8L，固体弃去；
2.3在每100ml清液中加入固体硫酸铵186g，达到65%饱和度，共用硫酸铵6.845kg，静置12小时；
2.4过滤，留取滤饼，称重180.2g，弃滤液；
2.5用720.8ml水溶解，再按2.1,2.2,2.3、2.4步骤分次加固体硫酸铵近35%和65%饱和度沉淀；
2.6取65%饱和度沉淀物，称重90.5g，用181ml水溶解，加入54.3ml饱和硫酸铵溶液，并用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.10 ;
2.7将溶液静置25°C恒温箱中48小时，有针状的糜蛋白酶粗品结晶析出；
2.8过滤，母液用0.25mol/L硫酸调节pH至2.9，其体积为234.7ml加入硫酸铵82.1g,静置15小时；
3.干燥工序:
取沉淀物，置真空干燥箱内干燥，即得胰蛋白酶粗品，称重60.9g，即每千克胰脏可得6.09克胰蛋白酶 2、胰蛋白酶精制生产操作:
1.投料
1.1称取胰蛋白酶粗品60.9g，先用152.25ml纯化水搅拌溶解，加3.0moI/L硫酸溶液调节PH至3.1，以助其溶解，搅拌12小时；
1.2计量溶液体积160.3ml，加入固体硫酸铵64.lg，待其溶解后，静置沉淀12小时；
1.3将溶液真空过滤，称量滤饼重量50.lg，加纯化水21.1ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调节PH至3.2，加入饱和硫酸铵溶液15.8ml，静止沉淀12小时；
1.4将溶液过滤，量取滤液体积36.5ml，加入饱和硫酸铵溶液36.5ml，静置沉淀15小时；
1.5洗镁:将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置I分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重48.2g，待活化；
2.活化
将滤饼溶于241.0ml0.01mol/L盐酸溶液，另加入1.5mol/L氯化钙溶液96.4ml及ρΗ8.5硼酸缓冲液192.8ml，再加入337.4ml纯化水，调节pH至7.5，最后加480mg活力较高的结晶胰蛋白酶进行活化处理，将溶液在5?10°C中静置72小时进行活化，第二天测pH值为7.4 ；
3.除钙
活化后的溶液用3.0moI/L硫酸溶液调节pH至3.2，溶液体积为820ml，再加入固体硫酸铵205.0g,搅拌溶解，在O?10°C中存放54小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液加入固体硫酸铵160.0g，在O?10°C静置12小时，过滤，得滤饼重量24.0g ；
4.结晶
滤饼加入pH9.0硼酸缓冲液48.0ml，用3.0moI/L硫酸溶液调节pH至8.1，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，5?10°C浸于外透液中，结晶5天，每2小时摇包一次；
5.透析
取出结晶液过滤得结晶物15.lg，加纯化水30.2ml溶解，用3.0mol/L硫酸溶液调节pH至2.9 ;将溶液装透析袋，然后挂于透析池中透析3天，去除盐类杂质，每12小时左右透析池换水一次，温度控制在5?10°C ；
6.冻干
取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽滤，得滤液，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.2，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品3.Sg，经测定其活性效价为2590iu/mg ;实施例3
取实施例2中制备的胰蛋白酶1250万单位，称取15g甘露醇，加500ml注射用水溶解，混合后调节PH值至6.0，然后再加注射用水至1000ml，聚醚砜超滤膜无菌过滤，分装于1000个已处理好的西林瓶中，冻干、乳盖即可。
[0011]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，包括以下步骤:(1)原料绞碎，抽提酶原；(2)分级盐溶、盐析；(3)结晶，得胰蛋白酶粗品；(4)粗品投料，多重结晶；(5)活化；(6)结晶；(7)透析；(8)冻干。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，各步骤具体为: (1)提取:将动物的胰脏绞碎成胰浆，用硫酸溶液浸渍，过滤，留取滤液； (2)盐溶、盐析:滤液中加入硫酸钱，使硫酸钱的饱和度达到30-50%，静置，过滤，留取滤液；滤液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到50-80%，静置，过滤，留取滤饼；所得滤饼加水溶解，加入饱和硫酸铵溶液，调节PH值至4.0-5.5 ； (3)结晶:溶液静置至有针状糜蛋白酶结晶析出；离心，调节pH值至2.0-5.0，在溶液中加入固体硫酸铵，抽滤；取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶粗品； (4)投料:取胰蛋白酶粗品，加水溶解，调节pH，搅拌；加入硫酸铵，溶解，静置；过滤，滤饼加水，搅拌溶解，调节pH，加入饱和硫酸铵溶液，静置；过滤，滤液中加入饱和硫酸铵溶液，静置；洗镁，待活化； (5)活化:将滤饼溶于盐酸溶液，加入氯化钙溶液及硼酸缓冲液，再加水，调节pH，最后加入结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液静置； (6)结晶:将活化后的溶液调节pH，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置，过滤，滤液加入固体硫酸铵，静置，过滤，得滤饼；滤饼中加入硼酸缓冲液，调节pH，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中； (7)透析:过滤得结晶物，加水溶解，调节pH;将溶液透析，去除杂质； (8)冻干:取出透析液，抽滤，得滤液，调节pH，冻干后得结晶胰蛋白酶成品。
3.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，步骤(I)中，所述动物胰脏为新鲜的牛胰脏、新鲜的猪胰脏；硫酸溶液的浓度为0.1-0.2mol/L ;胰浆与硫酸溶液的重量比为1:2~1:3 ;浸渍时间是20~28小时。
4.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，所述步骤(2)中，水与滤饼的重量比为1:1~3:1 ;调节pH值至4.0~6.0 ;加入的饱和硫酸钱溶液与滤饼的重量比为1:10~1:1。
5.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，所述步骤(3)中溶解静置环境温度为20~30°C ;调节pH值至2.0-5.0 ?’每100ml溶液中加入固体硫酸铵的重量为300~400g。
6.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，步骤(4)中，胰蛋白酶粗品与水的重量比为1:2-1:4，调节pH至3.0±0.5，搅拌10?16小时；每升溶液加入400?500g固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10?16小时。
7.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，步骤(5)中，称滤饼重量，加0.001?0.01mol/L盐酸溶液将滤饼溶解，加入0.5?2mol/L氯化钙溶液，以及pH7.5?8.5的硼酸缓冲液，再加入水，调节pH7.0?8.0，最后每克滤饼加5?15mg的结晶胰蛋白酶进行活化处理，pH值控制在7.0?8.0 ;所述盐酸溶液的加入量为滤饼重量的3?5倍，所述氯化钙溶液的加入量为滤饼重量的I?3倍，所述硼酸缓冲液的加入量为滤饼重量的4?6倍。
8.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，步骤(6)中，活化后的溶液调节pH至3.0±0.4，再按200?300g/L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在O?10°C中存放32?60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液中按150?250g/L加入固体硫酸铵，O?10°C时放置10?14小时，过滤，得滤饼；按每克滤饼加入I?2mlpH8.0?10.0硼酸缓冲液，调节pH至8.0±0.4，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中，温度控制在O?10°C。
9.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，步骤(7)中，按每克结晶物加入I?3ml水溶解，调节pH至3.0±0.5，温度控制在O?10 °C，透析2?4天。
10.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，其特征在于，步骤(8)中，调节pH至6.0±0.4。
11.一种药物组合物，其含有根据权利要求ι-?ο制备的胰蛋白酶作为活性成分，还含有甘露醇。
【专利摘要】本发明阐述一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物。该制备方法包括以下工艺步骤：（1）原料绞碎，抽提酶原；（2）分级盐溶、盐析，得胰蛋白酶粗品；（3）粗品投料，多重结晶；（4）活化；（5）结晶；（6）透析；（7）冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的胰蛋白酶精品效价达2500单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。
【IPC分类】A61K38-48, A61P11-00, C12N9-76, A61P29-00, A61P17-02
【公开号】CN104560926
【申请号】CN201410819906
【发明人】刘乃山, 林晓磊, 刘翠珍
【申请人】青岛康原药业有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月25日