一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] L-瓜氨酸（L-Citrulline)，化学名称为2-氨基-5-(胺基甲酰氨基）正戊酸。L-瓜 氨酸是一种α氨基酸，具备肽键合成能力但不作为蛋白质正常组成氨基酸。因最先从西瓜 中获取，而得名"瓜氨酸"。瓜氨酸是动物体内氨基酸代谢尿素循环的中间产物，从鸟氨酸及 胺基甲酰磷酸盐在尿素循环中生成，或是透过一氧化氮合酶（NOS)催化生成精氨酸的副产 物。L-瓜氨酸涉及了一系列的代谢过程，如尿素循环，精氨酸-瓜氨酸循环等。最近研究表 明，L-瓜氨酸能广泛应用于医药、食品、保健品多个方面。
[0003] L-瓜氨酸主要功效体现在以下几方面：1、治疗L-精氨酸缺乏引起的相关疾病；2、 防治前列腺疾病以及提高男性性功能；3、抗衰老和以及增强免疫力；4、提高运动员肌肉力 量与耐力；5、维护建康的肺功能、提高脑力清晰度；6、肾脏损伤患者透析时，增加创伤愈合 和改善微循环；7、治疗和缓解营养缺乏状况；8、作为异体排斥效应指示剂；9、类风湿关节 炎诊断试剂；10、降低压力和克服沮丧情绪。L-瓜氨酸以其独特的保健作用正被越来越广 泛地应用于食品药品行业、保健品行业和化妆品行业。许多科研机构以及医药研发中心投 入较多力量进行瓜氨酸制备工艺研究。
[0004] 目前，L-瓜氨酸的生产主要有化学法、提取法、酶法和发酵法。1、化学法：为L-瓜 氨酸的最早生产方法。在碱性条件下水解L-精氨酸制备L-瓜氨酸。反应过程控制较为困 难，污染大，且存在无法拆分DL-瓜氨酸旋光对应体等严重缺点。还有化学法报道通过L-鸟 氨酸盐酸盐与碱式碳酸铜保护氨基方法、利用尿素甲酰化生成二瓜氨酸合铜、再通过硫化 氢还原方法去除铜离子方法制备瓜氨酸。缺点为成本居高不下、产品纯度不高、环境污染巨 大。2、提取法：L-瓜氨酸通过提取的方法从西瓜汁、野西瓜叶、核桃仁以及葫芦科植物种子 中分离。但是此项技术分离纯化步骤繁琐、得到L-瓜氨酸纯度较低。原料来源受限制、规 模小、产率低等缺点都严重制约了提取法在工业上的应用。3、发酵法：发酵法为目前L-瓜 氨酸生产的主流方法。技术方法较为成熟，欧美对于此方面研究报道较多、日本研究比较深 入。有报道可以通过发酵法生产L-瓜氨酸的菌种有：Bacillus subtilis K-X-1A-9(ATCC I5562);石錯节杆菌 Arthrobacter paraffineus(日本 Kogyo 公司）；Eschierichia 菌 属；Kurthiasp. nov SK23. 003 (CN 102433289B);奠链球菌 Streptococcus faecalis BM-2CGMCC 4990(CN 102703339A)，SK23.001(CN 102433290A)。不利因素为终产物 L-瓜氨 酸的分离纯化困难以及最终L-瓜氨酸产率低的问题。4、酶法：L-瓜氨酸的酶法合成主要是 指通过体外克隆不同物种来源的精氨酸分解酶、精氨酸脱亚氨基酶（Arginine deiminase, 简称ADI)，催化底物精氨酸生成L-瓜氨酸。酶法合成L-瓜氨酸大都为一步酶催化反应。 具有底物、产物浓度高、转化反应特异性高、无对映体结构的优点。因此可以避免发酵法生 产L-瓜氨酸中复杂的反馈调节过程，直接投放底物L-精氨酸、实现高浓度L-瓜氨酸一步 催化合成。目前已有报道表明 Psudomonas putida ATCC4359、Pseudomonas fluorescen IF03081、Pseudomonas ovalis IAM1002、Leuconostoc citrovorum ATCC8081 等菌株以及 人支原体感染细胞分离物（CN 102321643A) ,Mycoplasma arginini(W02011/029696 Al)中 的精氨酸脱亚氨基酶具有L-瓜氨酸合成活性。
[0005] 酶法生产L-瓜氨酸由于具有周期短、产物分离纯化容易等突出优势而逐渐成为 瓜氨酸产业化研发的重要发展方向。但是目前报道大部分精氨酸脱亚胺酶大肠杆菌发酵单 位低，大部分以无活性包涵体形式存在，酶法催化前期过程需要包涵体变性复性过程，严重 制约直接酶法工业化生产而只能间接采用发酵法生产。解决这一问题的关键在于寻找到可 以应用于工业化生产的高活性精氨酸脱亚胺酶基因，制作高活性液体酶制剂或者固定化酶 应用于L-瓜氨酸的工业化生产领域。从而进一步提高底物浓度获得最佳L-瓜氨酸转化率 与收率，提高酶活力，降低生产成本。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是利用分子生物学手段，提供一种含点突变的高活性精氨酸脱亚胺 酶，为酶法瓜氨酸工业化生产提供有效途径。
[0007] 为了实现本发明所述目的，发明人提供了以下技术方案。
[0008] 一种突变的精氨酸脱亚胺酶，在K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个位点的氨 基酸突变。
[0009] 上述突变的精氨酸脱亚胺酶，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。
[0010] 上述突变的精氨酸脱亚胺酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0011] 一种重组载体，含有权利要求2-3任一权利要求所述核苷酸序列或氨基酸序列。 如PET系列载体、pWB980、pA0815等具备完整表达元件的可供目标序列表达的载体，含有操 纵子，启动子，筛选标记，核糖体结合序列，多克隆位点，终止子等必备元件。
[0012] 一种重组的宿主细胞，含有权利4所述重组载体。如大肠杆菌不同基因型，枯草芽 孢杆菌、酵母菌等可供表上述达载体表达的宿主细胞。
[0013] 本发明同时提供了上述突变的精氨酸脱亚胺酶的制备方法，包括以下操作：
[0014] (I)PCR引物设计
[0015] 引物为 ADI IF :5，-CGCGGATCCATGAAAATGGAACAAGCATTG-3，；
[0016] ADIlR :5' -ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC-3'
[0017]或
[0018] ADI2F ：CGCGGATCCCATGAAAATGGAACAAGCATTG ；
[0019] ADI2R ：ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC
[0020] 或
[0021] ADI3F ： CCGGAATTCATGAAAATGGAACAAGCATTG ；
[0022] ADI3R ：CCGGAATTCTTATTTTAGATTTTCTCTAAC ；
[0023] (2) PCR引物扩增ADI基因
[0024] 以 ADI1F、ADIlR 或 ADI2F、ADI2R 或 ADI3F、ADI3R 为引物，质粒 PUC 57-ADI 为模 板，扩增ADI基因，得到分别应用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母的待连接片段；
[0025] (3)易错PCR体系建立
[0026] 易错PCR体系：
[0027] IOxBuITcr C Mg2") 5μL dGTP (IOmM) dATP (IOmM) Ιμ? dCTP UOmM) S^iL dTTP (IOmM) 5μL Mg2- (25mM) 10μ? …物 ADllF (10μ Μ) 2μΙ. 2μΙ 模板 0.5 pL ddH20 18μ? Takara rtaq 0.5μL 总体积 50μΤ?
[0028] PCR反应条件为：
[0029] U 95 °C 5min ；
[0030] 2、95°C 30s，6(TC 30s，72°C lmin，30 个循环；
[0031] 3,72°C 5min ；
[0032] 获得含有随机突变位点的ADI片段，通过BamH I、Sal I双酶切的方式定向克隆载 体中，转化入BL21 (DE)3受体菌株，Amp筛选得到含有不同突变位点的重组质粒；
[0033] (4)突变菌株的筛选
[0034] 挑取含有不同突变位点的重组质粒单克隆菌株，进行培养、诱导、收集菌体，测定 活性，挑选活性提升的菌株；
[0035] (5)获取突变后的精氨酸脱亚胺酶
[0036] 筛选的菌株经过培养基活化，再通过摇瓶或发酵罐扩大培养并诱导表达后，离心 收集菌体，通过超声破碎或均质的方法破碎菌体即可获得精氨酸脱亚胺酶粗酶液，进一步 纯化后可获得纯度较高的精氨酸脱亚胺酶。
[0037] 上述突变的精氨酸脱亚胺酶在催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸中的应用。
[0038] 包含本发明所述核苷酸序列的表达载体可以采用含有必须表达元件（启动子、核 糖体结合位点、多克隆位点，筛选基因等）的所有载体，如Novagen公司的原核表达pET系 列的氨苄抗性载体、枯草芽孢杆菌表达载体pwb980、毕赤酵母表达载体pA0815, pPIC 9k 等。
[0039] 包含上述表达载体的宿主细胞，可以采用大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞以及 毕赤酵母细胞。由于ADI在不同宿主细胞中酶活力表现差异较大，因而优选酶活力最高的 大肠杆菌。在噬菌体高发季节，大肠杆菌细胞容易受噬菌体感染，传代不稳定，所以可以优 选枯草芽孢细胞或毕赤酵母细胞。
[0040] 本发明含有点突变的ADI基因可以通过其他途径如转染或侵染的方式转化到其 他宿主而获得相应的表达酶。或通过制备该酶的固定化酶来实现生产瓜氨酸目的。
[0041] 本发明所述是全基因合成Listeria monocytogenes精氨酸脱亚胺酶，通过易错 PCR技术获得K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个位点突变的精氨酸脱亚胺酶。将原始 基因与突变后的基因做酶活性比较，结果突变后大肠杆菌可溶性表达明显提高、酶活力具 有显著增强。
[0042] 本发明提供了一种1?活性ADI基因和蛋白序列，该ADI可1?效催化L-精氣酸水 解反应生成L-瓜氨酸以及氨。同时也提供了一种有效表达ADI的大肠杆菌、枯草芽孢杆 菌以及毕赤酵母表达系统。经5L发酵罐放大实验，大肠杆菌裂解菌体后上清酶活可达到 270000U/L。同时由大肠杆菌表达体系制备的ADI冻干粉具有大于8000U/g的比活力。此 夕卜，在L-精氨酸底物浓度大于200g/L时，添加终浓度为2-5g的该冻干粉具有接近99%的 产物生成率。同时该催化反应体系成分较为简单，仅需投入底物以及酶粉即可，不需额外添 加其他物质，因而，十分有利于底物L-瓜氨酸的分离和纯化，利于L-瓜氨酸的规模化生产， 因此，为进一步L-瓜氨酸大规模工业生产奠定了良好的基础。
【附图说明】
[0043] 图1为ADI的PCR产物图，图中1为PCR扩增条带，与预测大小一致（1233bp)，M1 为 Trans IK Marker，从上到下大小（bp)分别为 10000、8000、6000、5000、4000、3000、2000、 1000。
[0044] 图2-1为pET 21a-ADI酶切鉴定图，图中1为构建好的重组环质粒pET 21a-ADI， 2为其BamH I、Sal I双酶切后产物，从上到下大小（bp)分别为5300和1200, M2为Trans 15K Marker，从上到下大小（bp)分别为 15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500。
[0045] 图2-2为pWB 980-ADI