酶切鉴定图，图中1为其用BamH I、Sal I双酶切后产物，从 上到下分子量大小分别为3700和1200,2为构建好的重组环质粒pwb980-ADI，M2为Trans 15K Marker，从上到下大小（bp)分别为 15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500。
[0046] 图2-3为pA0815-ADI酶切鉴定图，图中1为构建好的重组环质粒pA0815-ADI，2为 EcoR I单酶切的产物，从上到下分子量大小分别为7700和1200，M2为Trans 15K Marker， 从上到下大小（bp)分别为 15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500。
[0047] 图3为ADI的大肠杆菌重组菌株诱导后SDS-PAGE图谱，图中M为蛋白marker图， 从上到下大小（kD)分别为97. 2、66. 4、44. 3、29. 0、21. 0 ;1为ADI的大肠杆菌重组菌株诱导 后上清，与预测大小一致（45kD)。
[0048] 图4为不同菌株摇瓶水平ADI酶活力变化趋势图。
[0049] 图5-1、图5-2、图5-3为HPLC动态检测底物精氨酸浓度258g/L时底物产物的动 态变化图，其中精氨酸的保留时间为5. 1分钟，瓜氨酸的保留时间为2. 7分钟；图5-1为反 应开始前，图5-2为反应Ih时取样，图5-3为反应结束后,此时未见底物精氨酸剩余。
[0050] 图6为不同底物浓度投入量时瓜氨酸的生成百分率图。
[0051] 序列表说明：
[0052] SEQ NO: 1为K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个点突变的精氨酸脱亚胺酶的 核苷酸序列。
[0053] SEQ N0:2为K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个点突变的精氨酸脱亚胺酶的 氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0054] 本发明利用基因工程技术，将全基因合成的ADI基因通过易错PCR技术对其原始 基因进行改造，将突变后精氨酸脱亚胺酶基因克隆到不同表达载体，并将相应的表达质粒 转化到相应的宿主菌如大肠杆菌BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌（WB600)或者毕赤酵母GS115表 达目的蛋白，然后对表达蛋白进行瓜氨酸生成活性测定。结果显示，本发明的ADI可高效催 化底物L-精氨酸反应生成L-瓜氨酸，具有非常高的转化率。
[0055] 实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》 (J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社， 2002)及毕赤酵母表达载体试剂盒（Invitrogen)中所述的方法进行。
[0056] 下面结合具体实施例对本发明所述内容作进一步详细的说明。
[0057] 实施例1精氨酸脱亚胺酶（ADI)编码基因的构建、易错PCR体系建立以及ADI活 性检测体系建立、HPLC方法测定精氨酸与瓜氨酸的条件
[0058] -、引物设计
[0059] 根据ADI全基因序列，以及大肠杆菌的表达载体pET_21a特点分别设计了初始构 建以及易错PCR前后突变引物（两者相同） ：
[0060] 引物 ADIlF :5' -CGCGGATCCATGAAAATGGAACAAGCATTG-3'（带下划线的碱基为 Bam HI识别位点）；
[0061] 引物 ADIlR :5' -ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC-3'（带下划线的碱基为 Sal I识别位点）。
[0062] 二、PCR引物扩增ADI目的基因
[0063] 分别以ADIIF、ADIlR为引物，质粒PUC 57-ADI (南京金斯瑞生物科技有限公司合 成）为模板，扩增ADI基因，其中PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、dNTP溶液均由TaKaRa 公司购得。
[0064] PCR反应体系为：
[0065] I OxBuilcr (Mg2+) 5μΙ dNTP (2.5mMcach) 4μΙ 引物 ADIlF (10μ Μ) 2μL 丨物 ADIlR ( ΙΟμ Μ) IyvL 模板 2pL
[0066] ddH20 34.5 μι Pyrobcsl DNA polymerase 0.5μ? 总体积 50μ?
[0067] PCR反应条件为：
[0068] 1、95°C 5min ;
[0069] 2、95°C 30s，6(TC 30s，72°C lmin，30 个循环；
[0070] 3、72°C 5min。
[0071] 结果如附图I所示，扩增到一条目的大小为1200-1300bp的条带，PCR扩增专一性 良好（如附图1所示），利用琼脂糖切胶回收试剂盒回收该PCR产物片段后，采用限制性内 切酶BamH I和Sail将PCR扩增产物定向连接入大肠杆菌表达载体pET-21a(购自Novagen 公司）中相应的位点，连接产物转化到感受态E. coli ToplO(购自全式金公司）中，然后在 含氨苄抗性（50 μ g/mL) LB平板（胰化蛋白胨10g/L ;酵母提取物5g/L ;NaCl 10g/L ;琼脂 粉15g/L)培养基上筛选阳性克隆，采用引物ADI1F，ADIIR(10 μ Μ)，菌落PCR的方法验证筛 选的阳性克隆（转化子）（如附图2-1所示），获得重组表达质粒命名为pET21a-ADI，将测 序正确的阳性转化子转入E. coli BL21(DE3)(购自全式金公司）中。将E. coli BL21(DE3) pET21a-ADI置于LB液体培养基（胰化蛋白胨10g/L ;酵母提取物5g/L ;NaCl 10g/L)中 37°C、200rpm震荡培养，至菌密度0D600为0. 6-0. 8时，加入终浓度为0. 2mM的IPTG于 16-20°C诱导18小时，表达精氨酸脱亚胺酶。
[0072] 三、易错PCR体系建立与突变菌株筛选
[0073] 易错PCR体系：
[0074] ]OxBuirer (小穴 Mg2+) 5μL dGTP ( IOmM) dATP (IOmM) dCTP ( IOmM ) 5μΙ dTTP ( I OmM) 5μ? Mg2+ (25mM ) 10μ? 引物 ADIlF (10μ M) 2pL 物 ADIlR (ΙΟμ Μ) 2μΙ 模板 0.5pL ddH20 18μ?
[0075] Takara rtaq 0_5μ? 总体积 5(^L
[0076] PCR反应条件为：
[0077] U 95 °C 5min ；
[0078] 2、95°C 30s，6(TC 30s，72°C lmin，30 个循环；
[0079] 3、72°C 5min。
[0080] PCR产物加入经过与原始ADI片段相同的构建方式最终转化入BL21 (DE3)菌株中。 通过挑取不同单克隆诱导表达的方式确定正向突变菌株，将比原始基因对应菌株酶活明显 提升的菌株提取质粒，测序确定突变位点。
[0081] 四、ADI酶活性检测方法以及HPLC检测方法建立
[0082] 1、化学显色法定义ADI酶活力
[0083] 瓜氨酸标准曲线建立：
[0084] 瓜氨酸母液配制（0· 2g/L):称量20mg瓜氨酸溶解入100毫升水中。4度保存。
[0085] 混酸：浓硫酸：浓磷酸体积比=1:3。
[0086] 显色液：称取双乙酰一肟I. 5g溶于50毫升水中，棕色试剂瓶常温保存。
[0087] 按照表1利用瓜氨酸母液分别配制以下浓度的瓜氨酸5毫升。
[0088] 表 1
[0089]
【主权项】
1. 一种突变的精氨酸脱亚胺酶，其特征在于，在K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五 个位点的氨基酸突变。
2. 根据权利要求1所述的一种突变的精氨酸脱亚胺酶，其特征在于，其核苷酸序列为 SEQIDN0:1。
3. 根据权利要求1所述的一种突变的精氨酸脱亚胺酶，其特征在于，其氨基酸序列为 SEQIDN0:2。
4. 一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2-3任一权利要求所述核苷酸序列或氨 基酸序列。
5. -种重组的宿主细胞，其特征在于，含有权利4所述重组载体。
6. 如权利要求1-3任一权利要求所述突变的精氨酸脱亚胺酶的制备方法，其特征在 于，包括以下操作： (1)PCR引物设计 引物为ADI1F:5' -CGCGGATCCATGAAAATGGAACAAGCAITG-3' ； AD11R: 5 ' -ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC-3 ' 或 ADI2F：CGCGGATCCCATGAAAATGGAACAAGCATTG； ADI2R：ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC或 ADI3F：CCGGAATTCATGAAAATGGAACAAGCATTG； ADI3R：CCGGAATTCTTATTTTAGATTTTCTCTAAC； (2) PCR引物扩增ADI基因 以ADI1F、ADI1R或ADI2F、ADI2R或ADI3F、ADI3R为引物，质粒PUC57-ADI为模板，扩 增ADI基因，得到分别应用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母的待连接片段； (3) 易错PCR体系建立 易错PCR体系：
PCR反应条件为： U95〇C5min； 2、95°C30s，6(TC30s，72°Clmin，30 个循环； 3,72〇C5min； 获得含有随机突变位点的ADI片段，通过BamHI、SalI双酶切的方式定向克隆载体 中，转化入BL21 (DE)3受体菌株，Amp筛选得到含有不同突变位点的重组质粒； (4) 突变菌株的筛选 挑取含有不同突变位点的重组质粒单克隆菌株，进行培养、诱导、收集菌体，测定活性， 挑选活性提升的菌株； (5) 获取突变后的精氨酸脱亚胺酶 筛选的菌株经过培养基活化，再通过摇瓶或发酵罐扩大培养并诱导表达后，离心收集 菌体，通过超声破碎或均质的方法破碎菌体即可获得精氨酸脱亚胺酶粗酶液，进一步纯化 后可获得纯度较高的精氨酸脱亚胺酶。
7.如权利要求1-3任一权利要求所述突变的精氨酸脱亚胺酶在催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用，所述突变的精氨酸脱亚胺酶在K137A、F198W、V230A、R257L、A260D中的任意一个或多个位点发生突变，突变后的精氨酸脱亚胺酶的活性明显提高，可用于催化L-精氨酸生产L-瓜氨酸，转化率在95％以上。突变的精氨酸脱亚胺酶采用易错PCR体系制备得到。
【IPC分类】C12N15-75, C12N9-78, C12R1-84, C12N1-19, C12N1-21, C12N15-81, C12N15-70, C12R1-19, C12N15-55, C12R1-125, C12P13-10
【公开号】CN104560927
【申请号】CN201510012021
【发明人】任丽梅, 刘健, 袁国强, 郭军臣, 赵英杰, 徐永龙, 李鹤, 李晓静, 成志远
【申请人】石药集团中诺药业（石家庄）有限公司）
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月9日