一种除锰功能菌的制作方法

专利名称：：一种除锰功能菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物。
背景技术：
：锰是地壳中含量丰富的金属元素，普通水体中锰离子的浓度为0.1lmg/L，而厌氧地下水中溶解性的锰离子浓度可高达79mg/L。可溶性锰经充氧曝气能够生成不溶性沉淀物(如Mn02或MnOOH)。Mn02是高度不可溶物质(S—Mn02的溶解度kso仅为10'56)，呈深黑色，可导致供饮用的地下水出现明显的色度；因此饮用水中的锰必须去除。我国规定饮用水中锰离子的最高浓度为0.1mg/L，而欧盟已将饮用水中锰离子的最高浓度确定为0.05mg/L。地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴随着锰离子的氧化、沉淀以及不溶性氧化产物的过滤分离。锰离子发生的非生物氧化反应如下-"她Ol)]=^[她(u)〗+&[她(n)][Ma]表明Mn(II)的氧化伴随着MnOx的自催化反应，这种自催化作用在饮用水锰处理工艺中较为重要。Mn(II)非生物氧化由氧作电子供体，通常在pH值大于9的条件下完成，低于9的pH条件下氧化反应速度极慢。绝大多数的饮用水pH在68之间，这种pH条件下Mn(II)不会发生氧化反应；因此饮用水中的猛不能通过简单的曝气和沉淀法去除。若加入化学药剂(如KMn04和C102)虽然除锰效果较为理想，但增加了工艺运行费用、反应残留物和生成的副产物，引起二次污染。生物氧化除锰具有良好的应用前景，但是目前生物氧化除锰主要利用自然选择建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除锰效果差，而且水处理过滤速度慢、不能超过10m/h。现有水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化和启动时间长；一旦工程菌群遭到破坏(中毒等原因导致工程菌死亡)其恢复周期长，在此期间出水中锰含量剧增、出水质量难以保证，致使该水处理设施不能正常运转，严重的将威胁人民群众的正常生活和生态环境。
发明内容本发明的目的是为了解决目前生物氧化除锰工程菌群靠自然选择建立，生化能力弱、除锰效果差，过滤速度慢；水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化、启动时间长和工程菌群遭到破坏后恢复周期长的问题，而提供的一种除锰功能菌。除锰功能菌MB32(尸"wc/owowwsp.)属于假单胞菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCCNo.2238;除锰功能菌MB32(尸"Wowo"assp.)为革兰氏阴性兼性厌氧菌，直或弯的短杆状，长为13pm，宽为l~1.5^im，细胞两端圆钝；在培养基上形成乳白色菌落，不透明，边缘不规则，四周微蓝；除锰功能菌MB32(/^^/omo"ossp.)具有能源贝亡存颗粒，有芽胞和荚膜，N，N，N，,N，-四甲基对苯二胺(N,N，N，,N，-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色为阳性。除锰功能菌MB32(尸化^/owcwassp.)能在pH值为5~8的环境中生长，具有脂肪酶和硝酸盐还原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脱氨酶和淀粉酶。除锰功能菌MB32(尸sewc/omo朋ssp.)细菌体内有类脂颗粒聚P-羟基丁酸(PHB)和异染颗粒聚合磷酸盐(Poly-P)，PHB和Poly-P都属于细菌细胞内的能源贮存颗粒，因此除锰功能菌MB32(尸"wAmo"wsp.)可以更好的适应低温、贫营养生长环境，具有恶劣环境适应能力强的优点；而且除锰功能菌MB32(尸化^fomowwsp.)有脱氮除磷的功能。本发明除锰功能菌MB32通过16SrDNA基因序列比对分析与其最相近的种属是假单胞菌属的Aewfifomo"oyputida(Dbj:D84020)，同源性为99%，因]t匕丰皮命名为sp.。本发明除锰功能菌MB32(尸"i^omo"wsp.)具有去除水中Mn"的能力，M^+去除率高于92%。本发明除锰功能菌MB32(尸^w^w7o"wsp.)的生化能力强、除锰效果好，可以直接投入使用，不仅縮短了水处理除锰生物滤池的建立时间，也可加快过滤速度，并且縮短了工程菌群遭到破坏后的恢复周期，可以在短暂的34小时内恢复水处理设施正常运行，保证了出水的质量。i^ew^mo"ossp.属于假单胞菌属(尸^i^omo"os)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，图5是除锰功能菌图6是除锰功能菌图7是除锰功能菌中国科学院微生物研究所，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCCNo.2238。图1是除锰功能菌MB32(户wi^omo"wsp.)的原子力显微镜图片；图2是除锰功能菌MB32(Psez^omowwsp.)的原子力显微镜图片；图3是除锰功能菌MB32(Pww^wwm^sp.)簇生的原子力显微镜图片；图4是除锰功能菌MB32(尸"Womo"ossp.)簇生的原子力显微镜图片MB32(尸"^fowo"wsp.)中类脂颗粒染色后观察图MB320P"Wowo"assp.)中异染颗粒染色后观察图MB32(尸"m^ww"似sp.)去除水中Mn"的时间曲线图，图7中"■"表示水中Mri"浓度曲线，""表示Mr+去除率曲线。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式除锰功能菌MB32CP"^/owo"oysp.)属于假单胞菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCCNo.2238;除锰功能菌MB32(尸"w^mo"wsp.)为革兰氏阴性兼性厌氧菌，直或弯的短杆状，长为13pm，宽为11.5nm，细胞两端圆钝(如图1和图2所示)；在培养基上形成乳白色菌落，不透明，边缘不规则，四周微蓝；除锰功能菌MB32(尸"i^fomomwsp.)具有能源贮存颗粒，有芽胞和荚膜，N,N,N',N'-四甲基对苯二胺(N,N，N'，N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色为阳性。除锰功能菌MB32(尸"^fowo"oysp.)能在pH值为58的环境中生长，具有脂肪酶和硝酸盐还原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脱氨酶和淀粉酶。除锰功能菌MB32(尸化^tomo"wsp.)常成簇排列(如图3和图4所示)。具体实施方式二本实施方式除锰功能菌MB32(i^ei^omomwsp.)是从辽宁省沈阳市张士生物除锰水厂的生物除锰滤池曝气池壁取泥中筛选得到的。筛选用1L培养基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，0.1gMnSO4.H2O，0.1gK2HPO4，0.2gMgSO4-7H2O，0.2gNaNO3，0.1gCaCl2，O.lg(NH4)2C03，O.OlgFeS04,7H20和余量的蒸馏水制成；然后灭菌。本实施方式采用平板划线与平板涂布法相结合进行分菌，采用TMPD法(VandenabeeleJ,DdeBeeretal.Manganeseoxidationbymicrobialconsortiafromsandfilters.Microb.Ecol.1992,24:91-108.)对分离所得菌种进行初筛。本实施方式采用TMPD法的原理是N,N,N'，N'-四甲基对苯二胺(N，N，N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可与四价锰反应生成蓝色物质WursterBlue,利用分光光度法通过测WursterBlue在420nm处的OD值可推知菌落具有Mr^+氧化能力的强弱(菌落无颜色变化的为阴性、无生物除锰功能)。本实施方式除锰功能菌MB32(fto^omo"assp.)16SrDNA测序工作由生物工程公司完成；其中PCR扩增正向引物BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，反向引物BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，。本实施方式除锰功能菌MB32(尸化w^wo"ossp.)16SrDNA序列如SEQIDNO.l所示。本实施方式除锰功能菌MB32(尸"^fomowwsp.)生理生化分析结果如表1所示。表1除锰功能菌MB32生理生化实验分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>生理生化实验结果表明除锰功能菌MB32(尸"w^wwmwsp.)是兼性厌氧菌，pH8时生长最好，适于在碱性环境中生长；5。C低温条件下仍可生长，典型低温菌种；具有脂肪酶和硝酸盐还原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脱氨酶和淀粉酶；可将水中的脂肪分解成甘油和脂肪酸，没有发酵葡萄糖产生乙酰四'基甲醇的能力，不能在糖代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸。除锰功能菌MB32CP"m^^o"msp.)有脂质颗粒聚(3-羟基丁酸(PHB)和异染颗粒聚合磷酸盐(Poly-P)，脂质颗粒PHB和异染颗粒Poly-P都属于能源贮存颗粒。除锰功能菌MB32(尸M^fowo"oysp.)中脂质颗粒染色后观察图如图5所示，除锰功能菌MB32(尸化w^wwwwsp.)中异染颗粒染色后观察图如图6所示。除锰功能菌MB32(尸"i^c^o"wsp.)的发酵上清液具有较高的除锰活性，试验表明除锰功能菌MB32(尸^^fowo"wsp.)能够分泌大量的除锰胞外蛋白酶。接菌培养除锰功能菌MB32(尸^^foww7ossp.)，液体培养液pH值为7.5，在12C低温条件下培养48h，然后向培养液中加入高浓度Mr^+溶液使培养液中Mn"的浓度为22.32mg/L，液体培养液中Mn"的浓度随时间的变化曲线如图7所示；12h内Mn"农度迅速下降由22.32mg/L降至5.71mg/L，12h后消减程度略趋平缓，36h后趋于稳定维持在1.8mg/L左右；36h内Mi^+去除率高达92.16%。实验证明，除锰功能菌MB32(尸^^owo"msp.)具有较高的生物除锰性能，且具有较高的胞外酶活性，通过48h的低温培养菌株向胞外分泌大量活性蛋白，活性蛋白与M^+相结合，使Mi^+转化为MnOx，得以去除。<110>哈尔滨工业大学<120>—种除锰功能菌<160>3<210>1<211>1536<212>DNA<213>除锰功能菌MB32CPwWowomwsp.)<220><223>除锰功能菌MB3216SrDNA基因序列<400>1tgatcctggctc3ga^ttg犯cgctggcggcaggcctaacacatgcaagtc60gagcggatgagaagagcttgctcttcgattC3gCggCgg3cgggtgagtaatgcctagga120atctgcctggt解tggggg3caacgtttcgaaagg犯cgctaataccgcatacgtcctac180ggg鄉鄉cagg卿ccttcgggccttgcgCt6Ltcagatgagcctaggtcggattagct240agttggtgaggt犯tggctcacc犯ggcgaCg3tCCgt犯ctggtctgag3ggstg3tca300gtcacactgg犯ctg站acacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggg肪tattg360g織atgggcg犯agcctgatccagccatgccgcgtgtgtga卿aggtcttcggattgt420aaagcELCttt鄉ttgggaggaagggcattaacctaatacgttagtgttttgacgttacc480gacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagc540gtt￡L3tCgg￡Lattactgggcgtaaagcgcgcgt鄉tggtttgttaagttggatgtg咖600gccccgggctc犯cctgggaactgcatccaaaactggcasgctagagtacggtagagggt660ggtgg犯Utcctgtgtagcggtg咖tgcgtsgatateiggaaggaacacCElgtggCg朋720ggcgaccacctgg已ctgatsggtgcggiaagcgtggggagcaaacagg8ttagataccctggtagtccacgCCgt3EL3Cg3tgtcaact3gccgttggaatccttgagatt840ttagtggcgcagctaacgcatt犯gttg3Ccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaa900ttgscgggggcccgcacaag-tgtggtttaacgcg犯g犯cctt已ccaggccttgacatgcagsgaactttCC卿g3tggattggtgcct1020tcgggaactctgacacaggtgctgcstggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttggg1080ttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcELCgttatggtgggcact1140Ct￡L￡tgg￡Lg￡LCtgccggtgaca犯ccggagga鄉"tgggg8tgacgtcaagtcatcatggc1200CCtt2LCggCCtgggctacacacgtgctacaatggtcggtac卿gggttgcc犯gccgcg12603ggtgg3gCt^tCtC3C犯犯ccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgc1320gtg鄉tcggaatcgctagtcagaatgtcgcggtgaat3cgUcccgggc1380Cttgt3C3CSccgcccgtcacaccatgggagtgggtt'gc已CC3g犯gt3gct3gtct犯c1440cttcggg鄉acggttaccacggtgtgaUc已tggctggggtg犯gtcgt3acaaggtag1500ccgt鄉ggaacctgcggctggatcacctccttaat1536<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据E.coli16SrRNA基因8~20bp设计PCR扩增正向引物BSF8/20序列。<400>2agagtttgatcctggctcag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据E.coli16SrRNA基因152(M541bp设计PCR扩增正向引物BSR1541/20序列。<400>3aaggaggtgatccagccgca20权利要求1、一种除锰功能菌，其特征在于除锰功能菌MB32(Pseudomonassp.)属于假单胞菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCCNo.2238；除锰功能菌MB32(Pseudomonassp.)为革兰氏阴性兼性厌氧菌，直或弯的短杆状，长为1～3μm，宽为1～1.5μm，细胞两端圆钝；在培养基上形成乳白色菌落，不透明，边缘不规则，四周微蓝；除锰功能菌MB32(Pseudomonassp.)具有能源贮存颗粒，有芽胞和荚膜，N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺染色为阳性。2、根据权利要求1所述的一种除锰功能菌，其特征在于除锰功能菌MB32(尸"t^owo"wsp.)能在pH值为5~8的环境中生长，具有脂肪酶和硝酸盐还原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脱氨酶和淀粉酶。全文摘要一种除锰功能菌，它涉及一种微生物。它解决了目前生物氧化除锰工程菌群靠自然选择建立，生化能力弱、除锰效果差；水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化、启动时间长和工程菌群遭到破坏后恢复周期长的问题。除锰功能菌MB32(Pseudomonassp.)属于假单胞菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCCNo.2238；菌株MB32为革兰氏阴性兼性厌氧菌，直或弯的短杆状，长为1～3μm，宽为1～1.5μm，细胞两端圆钝；在培养基上形成乳白色菌落，不透明，边缘不规则，四周微蓝；菌株MB32具有能源贮存颗粒，有芽胞和荚膜，N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺染色为阳性。本发明除锰功能菌MB32具有去除水中Mn²⁺的能力，Mn²⁺去除率高于92％。文档编号C12N1/20GK101215542SQ20081006381公开日2008年7月9日申请日期2008年1月7日优先权日2008年1月7日发明者杰张,冬李,焱赵申请人:哈尔滨工业大学