专利名称：还原型辅酶q10的制备方法
技术领域：
本发明涉及还原型辅酶Q10的制备方法，尤其涉及使用酶转化法制备还原 型辅酶Q10的方法。
辅酶Q10又名泛醌10，是一种脂溶性醌，在室温下是橙黄色结晶物，熔点 4S。C，无臭无味，其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链(聚异戊二烯 基的聚合度为IO而得名)，是一种醌类化合物，结构式如下
它的另一种形式为还原型辅酶Q10生理功能主要来源于醌基的氧化还原特 性和类异戊二烯侧链的物理特性，其在人体主要有两个作用， 一是有明显的抗 脂质过氧化作用，二是营养物质在线粒体内转化为能量的过程中起重要的作用。 其醌环在氧化呼吸链中起传递电子和质子的作用，这种作用不仅是所有生命形 式必不可少的，而且还是形成ATP的关键。它是细胞自身的天然抗氧化剂和细 胞代谢激活剂，具有保护和恢复生物膜结构的完整性，稳定膜电位作用，是肌 体的非特异性免疫增强剂。目前临床应用于心脏病，肝炎等疾病的辅助治疗。
在肌体内起上述2个主要作用的是辅酶Q10的还原型，所以生产还原型辅 酶Q10是直接的作用，特别是天然的还原型辅酶QIO。但是还原型辅酶Q10容 易被分子氧氧化，在工业规模生产还不能达成。此外还原型辅酶Q10是氧化型 辅酶Q10的二电子还原体，为白色结晶。已知用还原剂将氧化型辅酶Q10还原
背景技术：
方法生成还原型辅酶Q10的方法(如WO01/52822Al)。但是使用这种化学还原剂 所生产的还原型辅酶Q10在用于保健食品，饮料，化妆品，药品等时存在着分 子氧氧化的问题。至今还没有商业化还原型辅酶QIO。同时，怎么保护和稳定 还原型辅酶QIO，还没有一个真正的解决办法。
另外，现有的生产还原型辅酶Q10的方法上存在着大量使用化学还原剂或 者添加保护剂添加剂，有机溶剂等。用于药品食品化妆品等组合，无疑首先是 对环境的污染，其次用于人体是否安全，可靠显然存在有大量问题。特别是这 些还原剂，保护剂等的组合对人体的危害远大于辅酶Q10的正性作用。
发明内容
为了解决上述的还原型辅酶Q10制备存在的技术问题，本发明的目的是提 供一种使用酶转化法制备还原型辅酶Q10的方法，该方法制备得到的产品为纯 天然品，安全可靠。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案
还原型辅酶Q10的制备方法，该方法包括以下的步骤①氧化型辅酶Q10
原料进行磷酸化；②通过生物还原酶还原磷酸化的氧化型辅酶Q10;③提取还
原反应物中的还原型辅酶QIO。上述步骤的反应方程式如下
CH，
5作为优选，上述的步骤②中的生物还原酶的制备方法如下 (1 )选择含有辅酶Q10的细菌、酵母菌或真菌进行培养；
(2) 破碎细胞体，用30% 70%重量百分比浓度的硫酸胺沉淀；
(3) 分离沉淀物、透析得到所述生物还原酶。 采用上述的方法制备得到的生物还原酶与磷酸化的氧化型辅酶Q10具有良
好的还原性能，提高了还原型辅酶Q10的得率。
作为优选，上述的步骤(1)选用光合菌或红极毛杆菌。 作为优选，上述的步骤(2)破碎细胞体采用超声波细胞破碎机。 作为优选，上述的步骤(3)的方法如下沉淀后在35。C 45。C水浴1 2 小时，用冷冻离心机在rC 3'C， 10000 15000转/分钟的条件下离心10 30 分钟，弃上清，加入磷酸缓冲液透析。
作为再优选，透析后加入Sepharos4B搅拌，用磷酸缓冲液分三次清洗，加 氢氧化钠调PH8.5，解离；过滤后的液体用冷冻干燥机冻干，得所述的生物还原 酶。上述的方法提供生物还原酶的精制方法，提高生物还原酶的纯度。
作为优选，上述的步骤①中氧化型辅酶Q10进行磷酸化的步骤是:在28°C 45"C的条件下，将氧化型辅酶Q10溶解在磷酸缓冲液中，按照氧化型辅酶Q10 重量的2 10%加入磷酸脂或者任何一种磷酸脂盐类，搅拌10 120分钟。上述 的技术方案提供了一种氧化型辅酶Q10磷酸化的方法，该方法具有操作简便的 特点。
作为再优选，上述的磷酸缓冲液的PH值为6.0 8.2。
作为优选，上述的步骤③的提取方法如下膜压过滤反应物提取生成物， 对生成物进行真空浓縮，浓縮液中加入水，在2'C 1(TC温度条件下结晶，冷冻 干燥结晶物，即得到所述的还原型辅酶QIO。上述的技术方案提供了提取还原型辅酶Q10的方法，通过上述的方法提取，提高了还原型辅酶Q10的得率。 作为再优选，上述的膜压过滤的膜压为0.1MP 0.8MP。 本发明是由于采用了以上的技术方案，以天然生物酶转化氧化型辅酶Q10
来生产还原型辅酶QIO，不需要特定保护环境下就可以大规模生产还原型辅酶
QIO。所生产的还原型辅酶Q10具有以下的特点
① 稳定，不被空气中的分子氧以及化合物中的氧分子氧化。还原型辅酶QIO 原料在PH6.0 8.2的磷酸缓冲液中保持原有的性质，也可在5(TC以下的 条件下保存2年以上。
② 纯天然产品，没有还原剂的残留物，也没有任何抗氧化剂，保护剂等化学 制品。用于食品，药品，化妆品，安全可靠。
③ 原料磷酸化后既得辅酶Q10是一种真正意义上的水溶性物质，可用作于 针剂。
图1为本发明制备得到的还原型辅酶Q10的HPLC图谱。
具体实施例方式
实施例l
利用细菌制备生物还原酶的方法
一、 选种显微镜下红假单胞光合菌，菌体形态，为短杆或圆卵形，宽为 0.5-0.9微米，长1.2-2.0微米。牙芽胞，无荚膜，单极鞭毛，可运动的健康菌种。
二、 配制发酵液5.5克磷酸二氢钠，1.5克DL苹果酸，2.0克乙酸钠，2.0 克氢氧化钠，1.0克氯化铵，0.25克氯化镁，0.05克氯化钙，3.5克葡萄糖溶于 l.O升蒸馏水，搅拌均匀。测定PH应于6.5-7.0间。
三、 取250毫升三角瓶10只，每只灭菌后注入100毫升培养液，接种后密封。放置在32。C的光照培养箱中培养72小时，取出。
四、收集培养液，用6000转/分钟的离心机离心20分钟。离心后的菌体用 超声波细胞破碎机破碎，加入3%重量百分比浓度的盐水200毫升静置1小时。 取上清液，加入500毫升的50%重量百分比浓度的硫酸胺，40"C水浴1.5小时， 用冷冻离心机在4。C， 12000转/分钟条件下离心20分钟。弃上清，加入300毫 升磷酸缓冲液透析。加入100毫升Sepharos4B搅拌，用200毫升磷酸缓冲液分 三次清洗，加氢氧化钠调PH8.5，解离。过滤后的液体用冷冻干燥机冻干，得 80毫克生物还原酶。 实施例2
利用酵母菌制备生物还原酶的方法
一、 选禾中Schizosaccharomyces Promb(粟酒裂殖酵母)
二、 配制发酵液牛肉膏0.3克、蛋白胨1.0克、NaC10.5克、水100毫 升，调pH7.0 7,2在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨禾QNaCl，加热溶化后， 调节pH值至7.0 7.2。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌即成。
三、 取250毫升三角瓶10只，每只灭菌后注入100毫升培养液，接种后密 封。放置在35'C的光照培养箱中培养72小时，取出。
四、 收集培养液，用6000转/分钟的离心机离心20分钟。离心后的菌体用 超声波细胞破碎机破碎，加入3%重量百分比浓度的盐水200毫升静置1小时。 取上清液，加入500毫升的50%重量百分比浓度的硫酸胺，40'C水浴1.5小时， 用冷冻离心机在5。C， 12000转/分钟条件下离心20分钟.弃上清，加入300毫升 磷酸缓冲液透析。加入100毫升Sepharos 4B搅拌，用200毫升磷酸缓冲液分三 次清洗，加氢氧化钠调PH8.5,解离。过滤后的液体用冷冻干燥机冻干，得80 毫克生物还原酶。实施例3
利用真菌制备生物还原酶的方法
一、 选种Enophytic(内生多节胞菌)
二、 配制发酵液牛肉膏0.3克，蛋白胨1.0克，氯化钠0.5克，琼脂1.5 克，水100毫升。
三、 取250毫升三角瓶10只，每只灭菌后注入100毫升培养液，接种后 密封。放置在36。C的光照培养箱中培养72小时，取出。
四、 收集培养液，用6000转/分钟的离心机离心20分钟.离心后的菌体用超 声波细胞破碎机破碎，加入3%重量百分比浓度的盐水200毫升静置1小时。取 上清液，加入500毫升50%重量百分比浓度的硫酸胺，4(TC水浴1.5小时，用冷 冻离心机在2X:， 12000转/分钟条件下离心20分钟。弃上清，加入300毫升磷 酸缓冲液透析。加入100毫升Sepharos4B搅拌，用200毫升磷酸缓冲液分三次 清洗，加氢氧化钠调PH8.5，解离。过滤后的液体用冷冻干燥机冻干，得80毫 克生物还原酶。
实施例4
使用氧化型辅酶Q10为原料，在生物还原酶的作用下，转化成纯天然(即天 然品)还原型辅酶QIO。
一、 氧化型辅酶Q10磷酸化，在37'C的条件下，将250克氧化型辅酶Q10 溶解在1000毫升磷酸缓冲液中(PH7.4)。按照氧化型辅酶Q10重量的5%加12.5 克磷酸脂，搅拌30分钟。
二、 按照上述的实施例1 3的方法制备生物还原酶待用。
三、 在37。C 60。C的条件下，将制备好的磷酸化氧化型辅酶QIO，加入反 应器中，加入80mg制备的生物还原酶，搅拌10 30分钟；四、 膜压过滤采用0.5mp，在30"C条件下过滤，滤液放置2"C中5小时以
上；
五、 滤过液放在35'C， 200Pa的真空度条件下浓縮；
六、 浓缩物加入1000ml水洗3次，在2。C条件下结晶；
七、 结晶体在冷冻干燥机中干燥得248.2g，成品纯度99.4%;经检测，无氧 化型辅酶Q10的存在。
测试例1
取实施例4制备得到的还原型辅酶QIO，采用HPLC方法测定。 设备岛津S-10Avp 波长275nm
流动相乙醇甲醇=1 :1 (V: V)
柱子十八垸基硅胶柱；长180mm 内经3.2mm
称取还原型辅酶QIO
20mg，溶于乙醇至100ml，进样量20ul，外标三点法计算含量。 出峰时间8.974min。测定的图谱如图1所示。
权利要求
1.还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤①氧化型辅酶Q10原料进行磷酸化；②通过生物还原酶还原磷酸化的氧化型辅酶Q10；③提取还原反应物中的还原型辅酶Q10。
2. 根据权利要求1所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于步骤②中的生物还原酶的制备方法如下(1) 选择含有辅酶Q10的细菌、酵母菌或真菌进行培养；(2) 破碎细胞体，用30% 70%重量百分比浓度的硫酸胺沉淀；(3) 分离沉淀物、透析得到所述生物还原酶。
3. 根据权利要求2所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于步骤(l)选用光合菌或红极毛杆菌。
4. 根据权利要求2所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于步骤(2) 破碎细胞体采用超声波细胞破碎机。
5. 根据权利要求2或3或4所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于步 骤(3)的方法如下沉淀后在35"C 45'C水浴1 2小时，用冷冻离心机在 rC 3。C， 10000 15000转/分钟的条件下离心10 30分钟，弃上清，加入 磷酸缓冲液透析。
6. 根据权利要求5所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于透析后加 入S印haros 4B搅拌，用磷酸缓冲液分三次清洗，加氢氧化钠调PH8. 5，解 离；过滤后的液体用冷冻干燥机冻干，得所述的还原酶。
7. 根据权利要求1或2所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于步骤① 中氧化型辅酶Q10进行磷酸化的步骤是在28'C 45X:的条件下，将氧化 型辅酶Q10溶解在磷酸缓冲液中，按照氧化型辅酶Q10重量的2 10%加入 磷酸脂或者任何一种磷酸脂盐类，搅拌10 120分钟。
8. 根据权利要求7所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于磷酸缓冲 液的PH值为6.0 8.2。
9. 根据权利要求1或2所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于步骤③ 的提取方法如下膜压过滤反应物提取生成物，对生成物进行真空浓縮，浓 縮液中加入水，在2"C 10'C温度条件下结晶，冷冻干燥结晶物，即得到所 述的还原型辅酶QIO。
10. 根据权利要求9所述的还原型辅酶Q10的制备方法，其特征在于膜压过滤 的膜压为0.1MP 0.8MP。
全文摘要
本发明涉及还原型辅酶Q10的制备方法，尤其涉及使用酶转化法制备还原型辅酶Q10的方法。还原型辅酶Q10的制备方法，该方法包括以下的步骤①氧化型辅酶Q10原料进行磷酸化；②通过生物还原酶还原磷酸化的氧化型辅酶Q10；③提取还原反应物中的还原型辅酶Q10。本发明以天然生物酶转化氧化型辅酶Q10来生产还原型辅酶Q10，不需要特定保护环境下就可以大规模生产还原型辅酶Q10。所生产的还原型辅酶Q10具有稳定，纯天然产品，安全可靠、可用作于针剂的特点。
文档编号C12P7/26GK101307338SQ20081006312
公开日2008年11月19日 申请日期2008年7月17日 优先权日2008年7月17日
发明者乔 任, 雷 任 申请人:任 雷;任 乔