专利名称：：肠道病毒ev71核酸荧光定量rt-pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种肠道病毒EV71核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法，可应用于手足口病等暴发疫情的实验室应急检测。(二)
背景技术：
手足口病(HandfootmouthdiseaseHFMD)是婴幼儿常见的传染病，由肠道病毒引起，临床上以发热和手、足、口腔等部位出现皮渗、溃疡等表现为主，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报导。今年3月上旬，安徽阜阳几家医院陆续收治了以发热伴口腔、手足臀部皮渗为主的疾病患儿，经实-睑室4企测，确定该病为肠道病毒EV71感染。目前，广东、浙江、山东、北京、上海等地均发现疫情。截止5月9日止，全国感染手足口病近2.5万例，造成34名患儿死亡。中国手足口病的爆发流行引起了全球的关注，卫生部已将手足口病纳入国家丙类法定报告传染病，通过网络直报系统对疫情进行监测。由于HFMD是由多种人肠道病毒感染引起，其中以EV71及CoxA16型最为常见，为了对该病迅速查明病因，及时采取控制措施，急需进行实验室快速诊断，但肠道病毒传统的检测方法是病毒分离和中和法定型，繁瑣费时，不适合早期诊断。(三)
发明内容本发明目的是提供一种手足口病感染实验室应急检测的肠道病毒EV71萸光RT-PCR检测试剂盒及检测方法。本发明采用的技术方案是一种肠道病毒EV71核酸荧光定量RT-PCR4企测试剂盒，所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的引物和4笨针序列如下EV71YGF1:5，-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA-3';EV71YGRl:5,-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3';EV71YGpbl:5'画TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3,。此外本试剂盒中还包括dNTP,MgCl2,RNase抑制剂，AMV逆转录酶，Taq酶等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。本发明还涉及肠道病毒EV71核酸的荧光定量RT-PCR检测方法，所述方法包括(1)根据肠道病毒EV71基因序列，设计引物和探针序列如下EV71YGF1:5，-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA誦3';EV71YGRl:5，-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3';EV71YGpbl:5'-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC陽3，；(2)提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1)所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据焚光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有肠道病毒EV71核酸。本发明关键在于引物和探针序列的设计，RT-PCR反应体系组成、反应条件选择和反应结果判断均可按本领域常规方法进行。所述RT-PCR反应体系每25nL组成如下优选的，所述荧光定量RT-PCR反应体系每25juL组成如下RT-PCR緩冲液终浓度为lxExTaqHS0.1U/|uLRTEnzymeMixII0.1U/|LiL上游与下游引物各0.40pM探针0.20fiM模板RNA8|LiLDEPC水补足至25juL。所述RT-PCR緩沖液为onestepRT-PCR緩沖液，其终浓度为1x,是指緩冲液各组分在反应体系中的终浓度与1xonestepRT-PCR中各组々的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2xonestepRT-PCR。优选的，所述荧光定量RT-PCR反应条件为42°C30min,95°C2min进行逆转录，然后95。C5s，55°C35s，在55。C进行单点荧光检测，共进4亍40个循环。所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasyMiniKit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。HFMD由人肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5型；埃可病毒(ECHOviruses)和肠道病毒71型(EV71)感染引起，其中以EV71及CoxA16型最为常见。EV71感染儿童引起的手足口病大部分病例病情较轻，可治愈,但少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎和肺水肿等并发症，严重时可危及生命。对手足口病爆发疫情尽早作出实验室确诊是及时采取防控措施与对诊治疗的关键。肠道病毒检测传统的方法是采用细胞培养进行病毒分离，然后用肠道病毒组合血清进行型别鉴定，该方法虽然正确可靠，但繁杂耗时，不适应早期应急诊断。近年来，随着分子生物学技术的发展，采用RT-PCR技术对肠道病毒进行诊断国内外已有报导，它具有灵敏度高，特异性强，所需时间短等优点，目前已在肠道病毒的核酸检测中得到应用[4-6],但其检测时间仍需67h,且容易由于PCR扩增产物污染而产生^f叚阳性。近几年发展起来的以特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，不仅能大大减少扩增产物污染的机会，而且较常规RT-PCR技术，无论从敏感性，特异性与速度上都更具有优势，当然它对引物和探针的设计也提出了更高的要求。本申请发明人从美国的NCBI基因库上下载了近二十年来世界各地的肠道EV71毒林，对其进行了同源性比较，在EV71的VP1区设计若干对引物与Taqman探针，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最佳的引物和探针，并对荧光RT-PC方法进行优化，验证其每l感性、特异性和重复性。经肠道病毒标准抹、EV71毒株与近期手足口病爆发疫情疑似患者临床样本的检测比较，该方法具有高特异性，只能检出肠道EV71型，与其他肠道病毒如柯萨奇A组CA4、CA16、CA21、柯萨奇B5、艾苛病毒E6、E30、POLIOI型等毒株均无交叉反应，而且比常规RT-PCR法更敏感、快速和简便。肠道病毒EV71的RT-PCR检测敏感度在l.OTCIDso左右，从病毒核酸提取、RT-PCR反应与电泳，整个过程大约需6~7h左右，而采用本方法从核酸提取至完成检测，仅需3h左右，能同时完成多个疑似患者临床样本的高通量检测，敏感度达0.1TCID5G,比普通PCR的灵敏度高10倍左右，可直接从手足口病患者的脑脊液、粪便、疱疹液等临床样本中检测肠道病毒EV71核酸，而且EV71核酸阳性的样本可与肠道病毒通用荧光RT-PCR法检测的肠道病毒核酸互相验证。用建立的新方法，对近期浙江省疑似手足口病爆发疫情疑似患者120份临床样本进行实验室早期快速诊断，获得了令人满意的结果，为该病及时采耳又控制措施发挥了很好的作用。本发明的有益效果主要体现在本发明方法对肠道病毒EV71的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒CA16、CA4、CA21、E6、E30、CoxB5、POLIO等病毒无交叉反应；本发明方法检测的灵敏度达0.1TCID50,可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱渗液和粪便等标本中检测肠道病毒EV71核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右；本发明方法一种快速检测肠道病毒EV71特异、敏感的方法，非常适用于手足口病等由肠道病毒EV71感染引起突发疫情的实验室早期诊断。(四)图1为肠道病毒EV71荧光RT-PCR方法特异性试验结果；A:肠道病毒EV71;B和C:手足口病患者的疱渗液；图2为荧光RT-PCR法检测肠道病毒EV71的灵敏度；AE分别代表不同的病毒浓度，乂人A至E依次为1000、100、10、1、0.1TCIDso;图3为荧光RT-PCR法检测手足口病疑似患者临床样本中肠道病毒EV71核酸；A:肠道EV71阳性对照，B:手足口病疑似患者临床样本的检观'J。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:1材料与方法1.1病毒林与临床标本肠道病毒EV71、柯萨奇A组(CA)CA4、CA16、CA21、柯萨奇B5、E6、E30、POLIO1型等病毒林来源于中国医学科学院、北京生物制品研究所和浙江省疾病预防控制中心分离林。临床样本来源于近期浙江省手足口病爆发疫情疑似患者的脑脊液、疱渗液、粪便等，样本采集后带冰运送到实验室。1.2引物与探针从GenBank上下载不同年份和地区的肠道病毒EV71基因序列，用生物学软件进行同源性比较，在VP1区设计特异性引物和TaqMan探针，序列为EV71YGFl:5，-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA-3,，EV71YGRl:5，-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3，，EV71YGpb1:5，-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC—3'。引物和探针委托上海基康生物工程有限公司合成。1.3病毒定量标准与病毒RNA的提取以肠道病毒EV71为标准毒株，用人横紋肌瘤细胞(RD)进行病毒效价滴定(1062TCID5。/ml)后作为参考林，将其稀释至IOOO、100、10、1、0.1、0.01TCID5o每个反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的ReansyMiniKit,按试剂盒说明书提取。1.4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化试剂盒选用Takara^^司的onestepPrimeScriptRT-PCR(PerfectRealtime),Code:DRR064A,按说明书操作，反应体系为25pl，其中2xonestepRT画PCR緩沖液12.5ul,ExTaqHS(5U/|il)0.5ul,RTEnzymeMixII(5U/|il)0.5ul(试剂盒自带)，上游与下游引物(20(imol/L)各0.6(al，探针(20pmol/L)0.3|ul,模板RNA8(al，DEPC水1.5|il。反应条件为42°C30min,95°C2min进行逆转录，然后95°C5s，55°C35s,在55。C进行单点荧光4全测，共进行40个循环。结果判断选择荧光检测模式FAM,荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度乂人100~900(imo1/〗笨针浓度从50~300jmiol/采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ARn)选择最佳引物和探针浓度。1.5RT-PC版应肠道病毒EV71RT-PCR引物序列，上游159S:5，匿ACYATGAAAYTGTGCAAGG-3，，下游162A:5'画CCRGTAGGKGTRCACGCRAC-3'。扩增片断448bp。采用TAKARA公司onestepRT-kit(code:DRR024A)，按试剂盒说明书操作，反应体系为25|11,其中10xRT-PCR緩沖液2.5ul,MgCl225ul(25mM),dNTP混合物(各10mM)2.5|ul,RNase抑制剂(40U/|al)0.5^1,AMV酶(5U/pl)0.5ul,Taq酶(5U/|il)0.5ul，上游与下游引物(20^M)各0.5|il，模板RNA8|ul,DEPC水4.5(J。反应条件为50。C30min,95°C3min进行逆转录，然后95。C20s,50°C25s,72°C30s进4亍扩增，40个循环后转入72。C10min,取8iul产物电泳后判断有无特异性条带(448bp)。1.6焚光RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验选择肠道病毒EV71C型毒林柯萨奇A组CA4、CA16、CA21、柯萨奇B5、艾柯病毒E6、E30、POLIO1型和近期手足口;^暴发疫情疑似患者的脑脊液、疱渗液和粪便等临床样本，对上述病毒抹和样本分别提取核酸，用肠道病毒EV71荧光RT-PCR方法进朽-;险测，^验-〖正方法的特异性；对已标定TCID50的肠道病毒EV71型(1062TCID50/ml)稀释后分别提取RNA,平行进行荧光RT-PCR与RT-PCR反应，比较其灵壽丈度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作3次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。2结果2.1荧光RT-PCR反应体系及条件采用TAKARA公司的一步法焚光RT-PCR试剂盒，总反应体系为25ILil。矩阵法优选后引物最佳浓度均为0.4pM，探针最佳浓度为0.2pM,模板RNA8jil，最后用DEPC水补至25jil。用MJResearchOption2荧光斗企测系统进行才企测，反应参凌史为42°C30min逆转录，95。C变性2min,以95。C5s,55。C35s扩增40个循环，在55。C进行单点焚光纟企测，可获得最低Ct值和最高荧光强度。2.2特异性试验本发明建立的荧光RT-PCR方法对肠道病毒EV71具有较好的特异性，对其他肠道病毒如CA16、CA4、CA21、E6、E30、COXB5、POLIOl型等无交叉反应，近期流行的手足口病患者的疱渗液显示阳性反应。结果见图1。2.3敏感性试验对肠道病毒EV71毒株，采用RD细胞进行病毒效价测定(1062TCID50/ml),然后稀释成1000、100、10、1、0.1、0.01TCID50,提取病毒RNA,分别用焚光RT-PCR与常规RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法^r测每丈感性达到0.1TCID5。，RT-PCR方法4企测每丈感性达1.0TCID5Q,荧光RT-PCR方法比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍左右(见图2)。2.4重复性试-验肠道病毒EV71毒株按10倍梯度稀释成4个不同的浓度，对每一个浓度的样本作3个重复纟全测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.05~0.29之间，具有较好的重复性(表1)。表1荧光RT-PCR法检测肠道病毒EV71的重复性试验<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.5临床样本的检测从近期浙江省各地报告的手足口爆发疫情疑似患者的脑脊液、粪便和疱渗液共120份临床样本中直接提取病毒RNA，用肠道病毒通用荧光RT-PCR方法(采用TAKARA/^司的一步法荧光RT-PCR试剂盒，总反应体系为25pl。矩阵法优选后引物最佳浓度均为0.60(amol/L,探针最佳浓度为O.30|imol/L，模板RNA10|^1，最后用DEPC水补至25|iil。用MJResearchOption2荧光检测系统或RocheLightcycle焚光^r测系统进行4企测，反应参数为45°C30min逆转录，94。C变性2min，以93°C15s,60。Clmin扩增40个循环，在60。C进行单点荧光检测，可获得最低Ct值和最高荧光强度)(严菊英，卢亦愚，徐昌平，等。肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR法快速冲企测，中国公共卫生，2007，(7))、本发明肠道病毒EV71荧光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法(见操作1.5)同时检测肠道病毒和肠道EV71病毒核酸，结果肠道病毒通用焚光RT-PCR方法检测出肠道病毒核酸阳性84份，本发明肠道病毒EV71荧光RT-PCR方法4企测出肠道EV71核酸阳性49份，普通RT-PCR法检测出EV71核酸阳性41份，本发明肠道病毒EV71荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR法检测EV71的阳性率高。所有肠道EV71核酸阳性的样品肠道病毒核酸均阳性。本发明肠道病毒EV71荧光RT-PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果，图3显示的是部分临床样本的检测图谱。序列表—ST25SEQUENCELISTING<110>浙江省疾病预防控制中心<120>肠道病毒EV71核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法<130〉<160>3<170>Patentlnversion3.4<210>1〈211〉26〈212>DNA<213〉Unknown〈220〉<223〉人工序列<400〉1tgattgagacacgcgtgtgttcctta26<210〉2<211>20<212>DNA<213>Unknown<220〉<223>人工序列〈400〉2cccgctctgctgaagaaact20<210〉3〈211>25<212>腿<213>IInk腳n<220〉〈223〉人工序列<400>3tcgcacagcacagctgagaccactc2权利要求1.肠道病毒EV71核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的引物和探针序列如下EV71YGF15’-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA-3’；EV71YGR15’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’；EV71YGpb15’-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3’。2.肠道病毒EV71核酸的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于所述方法包括(1)根据肠道病毒EV71基因序列，设计引物和探针序列如下EV71YGF1:5，-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA隱3';EV71YGRl:5，-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3';EV71YGpbl:5'画TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3，；(2)纟是取待测样品RNA,以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1)所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有肠道病毒EV71核酸。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述RT-PCR反应体系每25HL组成如下RT-PCR緩冲液终浓度为lxExTaqHS0.1U/|liLRTEnzymeMixII0.1U/pL上游与下游引物各0.40pM探针0.20)iM模板RNA8|liLDEPC水补足至25|uL。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述荧光定量RT-PCR反应条件为42°C30min，95°C2min进行逆转录，然后95°C5s,55°C35s,在55"C进行单点荧光检测，共进行40个循环。全文摘要本发明提供了一种应用于手足口病感染实验室应急检测的肠道病毒EV71荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法。所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的引物和探针序列如下EV71YGF15’-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA-3’；EV71YGR15’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’；EV71YGpb15’-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3’。本发明方法对肠道病毒EV71的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒CA16、CA4、CA21、E6、E30、CoxB5、POLIO等病毒无交叉反应；本发明方法检测的灵敏度达0.1TCID<sub>50</sub>，可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒EV71核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。文档编号C12Q1/68GK101328507SQ20081006309公开日2008年12月24日申请日期2008年7月10日优先权日2008年7月10日发明者严菊英,燕冯,卢亦愚,徐昌平,寅陈申请人:浙江省疾病预防控制中心