猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法

专利名称：猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物疫苗技术领域，尤其属于对猪繁殖与呼吸综合征进行免疫保 护的二价重组腺病毒疫苗及其制备方法。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的，以妊娠母猪流产、死胎、 弱仔等繁殖障碍及仔猪的呼吸道征状和高死亡率为特征的传染病。
自1987年在北美首次报道以来，至今几乎扩散到全球所有养猪业发达的国 家和地区，给养猪业及其产品贸易造成了巨大的经济损失，已成为养猪业的主 要病毒性疾病之一。我国于1995年底爆发该病，随后迅速蔓延到全国大部分省 份。近年来PRRS疫情又有加重趋势，且混合感染和持续性感染状况严重。目前 用于预防PRRS的疫苗主要是传统疫苗一弱毒苗和灭活疫苗。尽管弱毒苗能提供 较好的免疫保护，但存在毒力返强和散毒的危险；而灭活苗诱导产生的抗体水平 很低，且极不稳定。因此，研制更安全、更有效的疫苗来预防和控制该病的发 生与流行已迫在眉睫。
PRRSV是一种单股正链的RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)动脉 炎病毒科(Arterividae)动脉炎病毒属(Artervirus),同属的还有马动脉炎 病毒(EAV)、小鼠乳酸脱氢酶增高征病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)。其基因 组大小约15kb，具有9个开放阅读框架(ORFs)，且彼此相互嵌套。ORFl(包括 ORFla和ORFlb)编码病毒的复制酶，其大小约占全基因组的3/4; ORFs 2 4分 别编码病毒的GP2a、 GP2b、 GP3和GP4 4种次要结构蛋白，ORFs 5 7编码3种
主要结构蛋白GP5、 M和N。 GP5为囊膜糖蛋白，是一种多功能蛋白，参与细胞 免疫与体液免疫，尤其是中和抗体的产生，是基因工程疫苗设计的主要靶抗原； M蛋白是非糖基化膜蛋白，具有较强的免疫原性，可诱导产生一定的中和抗体和 特异性细胞免疫应答，在介导病毒的吸附和诱导细胞免疫中具有重要作用；而 GP5与M蛋白可通过二硫键形成GP5/M异源二聚体，对病毒装配起重要作用，并 介导病毒吸附宿主细胞过程。
目前，大多数研究者为了发挥GP5的病毒中和优势作用和M蛋白的细胞免疫 作用及两者所形成的二聚体对病毒进入靶组织和细胞的作用，通过不同的表达 系统共表达和融合表达此二者，即在同一表达系统中使用双启动子(Yunbo Jiang et al. ， 2006， Vaccine, 24,2869-2879; Qisheng Zheng et al" 2007, Virus Genes, 35,585-595);或在GP5和M蛋白基因之间引入内部核糖体进入位点(IRES)(李 俊等，2006，动物医学进展，27(10) :78-81);或通过一柔性多肽Linker序列 (Wenming Jiang et al" 2006, Veterinary Immunology and Immunopathology ， 113,169-180)将GP5和M蛋白基因连接一起的表达策略。但这些策略存在一些 缺陷，比如被表达的基因起始效率低、上游基因与下游基因的表达严重不平衡、 启动子之间相互干扰、被表达蛋白性质与其天然蛋白的性质不尽相同等问题。

发明内容
本发明目的是，针对以往为利用GP5和M蛋白基因功能，所采用的双启动子、 或引入内部核糖体、或通过一柔性多肽序列等将两者相连接表达策略所存在的 被表达基因起始效率低、上游基因与下游基因表达严重不平衡、启动子之间相 互干扰、或被表达蛋白性质与其天然蛋白性质不尽相同等缺陷，研制一种能克 服上述缺陷的，并使受体猪能产生针对PRRSV特异性的中和抗体和较强的细胞 免疫力，以达到有效控制、治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型二价重组
腺病毒基因工程疫苗；本发明的另一目的是提出该疫苗的制备方法。 本发明目的通过以下技术方案得以实现
猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗，该疫苗可通过在PRRSV GP5和M 蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV 2A基因相连接，构建成GP5-2A-M融合蛋 白基因，并与腺病毒骨架载体pAdEasy-l同源重组，将重组病毒DNA经酶切， 转染HEK-293A细胞后，得重组腺病毒rAd-GP5-2A-M，经腺病毒纯化、扩增等工 艺、步骤，制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。
猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗的制备方法，该方法按以下步骤进
行
(1) GP5-2A- M融合基因的构建根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332 和FMDV China/99 0型毒株的基因序列，各设计一对针对PRRSV国内分离株NB/04 毒株GP5、 M和2A基因的特异性融合引物，引物序列如下
AdGP5: 5' -CGC f CT i CCA CCA TGG TGG GGA AAT GCT TG-3'
AdGP5-2A: 5" -AAC GTC TCC TGC TAA CTT CAA AAG ATC AAA GTT CGT GAG ACG ACC CCA-3'
AdM-2A:5， -TTA GCA GGA GAC GTT GAG TCC MC CCC GGA CCC ATG GGG TCG TCT CTA-3'
AdM: 5' -TAT (707 TAT TTG GCA TAT TTA AC-3'
以Marc-145细胞增殖NB/04毒株，提取其RNA，以AdM引物作RT;然后以 cDNA产物为模板，应用PCR技术扩增出NB/04毒株含FMDV 2A基因的GP5和M 全基因，再通过融合PCR技术，以AdGP5和AdM引物将GP5、 2A和M蛋白基因 融合为GP5-2A- M融合基因；
(2) 穿梭载体pShuttle-CMV- GP5-2A-M的构建在步骤(l)融合基因GP5-2A-
M的GP5的上游和M的下游引物的5'端引入相应的限制性内切酶Kpnl和Notl， 通过这两个酶切位点，把GP5-2A-M融合基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中， 通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5-2A-M融合基因的穿梭载体 pShutt1e-CMV-GP5-2A-M;
(3) 穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M与腺病毒骨架载体pAdEasy-1的同 源重组与纯化将步骤(2)鉴定含有GP5-2A- M融合基因的穿梭载体 pShuttle-CMV-GP5-2A-M用酶切、去磷酸化后，电转化至己转入腺病毒骨架载 体pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌细胞，进行菌内同源重组；用卡那霉素筛选 获得重组病毒DNA， Pacl酶切鉴定，将其中正确的重组病毒DNA再转化XL10— Gold超级感受态细胞，以纯化重组腺病毒DNA;
(4) 重组腺病毒rAd-GP5-2A- M的获得与鉴定鉴定好的重组腺病毒DNA 经过Pacl酶切线性化后，转染HEK-293A细胞内，重组腺病毒DNA在胞内包装 成完整的重组腺病毒rAd-GP5-2A- M;通过噬斑纯化后，采用RT-PCR、 IFA和 Western blot方法检测GP5-2A-M聚合蛋白的基因转录、表达及蛋白裂解；
(5) 重组腺病毒的扩繁与检测将步骤(4)鉴定、纯化后的重组腺病毒 rAd-GP5-2A-M在HEK-293A细胞内连续传代30次，其中，每5代检查一次重组 腺病毒对GP5-2A- M融合蛋白基因的转录、表达与裂解情况，同时测定其TCID5。， 从中筛选出表达稳定，接毒后细胞病变(CPE)稳定，种毒毒价稳定在l(T43 TCID5。/1. 0ml的重组腺病毒，-8(TC保存；
(6) 二价重组腺病毒疫苗的制备取步骤(5)重组腺病毒，按101。 TCID5。 接种于HEK-293A细胞上，进行扩大病毒培养；当细胞病变达70-90%时收毒，经 冻融3次即可获得PRRSV重组腺病毒rAd-GP5-2A-M疫苗，经质检、分装、包装 后即成。
本发明有益效果
1、 本发明在表达的GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解功能的FMDV 2A 基因，构建成一个表达框内可同时表达PRRSV GP5和M蛋白的多顺反子重组腺 病毒，并使聚合蛋白GP5-2A-M在表达后裂解为GP5和M蛋白，即时发挥出GP5 的病毒中和优势作用和M蛋白的细胞免疫功能；该技术突破了以往多基因表达 一般多通过效率低、工作量大的多个携带单基因独立载体表达系统；或通过基 因起始效率低，上游基因与下游基因表达严重不平衡的在基因之间引入内部核 糖体进入位点，或多启动子及表达融合基因等方法。
2、 本发明采用人腺病毒血清5型载体为表达载体，可对目的蛋白进行有效 的表达，对人、猪等动物没有致病性，感染动物后不出现临床征状。
3、本发明重组腺病毒疫苗其效价稳定，种毒毒价稳定在1(T43 TCID5。/1.0ml， 兼有常规弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性，通过小鼠免疫试验和中和 试验，证明该重组腺病毒产生了针对PRRSV的中和抗体和较强的细胞免疫，其中 和抗体效价为1:128，改变了PRRSV感染猪后其中和抗体产生量少且慢的不足； 这为当前难以防治的猪繁殖与呼吸综合征提供了一种优质、高效的二价重组腺
病毒疫苗o


图l 重组穿梭载体rShuttle-CMV-GP5-2A-M构建示意图
图2重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的构建与获得示意图
图3 PRRSV-NB/04 GP5和M蛋白基因的PCR产物电泳图
1: 250bp DNA Marker; 2: M蛋白基因PCR片段；
3: GP5蛋白基因PCR片段； 图4 GP5-2A-M基因的融合PCR产物电泳图
1: DL2000 DNA Marker; 2: GP5-2A-M基因融合PCR片段； 图5重组Shuttle-CMV-GP5-2A-M质粒Kpnl/Notl酶切鉴定结果电泳图
1: DL15000 DNA Marker; 2:重组质粒Kpnl/Notl酶切产物； 图6重组质粒DNA电泳图
1: DL15000 DNA Marker; 2_5: 4个不同重组质粒DNA克隆； 图7重组质粒DNA的PacI酶切鉴定电泳图
1: DL15000 DNA Marker; 2:重组质粒pAd-GP5-2A-M的Pad酶切； 图8重组腺病毒表达GP5-2A-M聚合蛋白的mRNA的检测电泳图
1: 250bp DNA Marker; 2:感染重组腺病毒的HEK-293A细胞提取总
RNA的RT-PCR;
图9重组腺病毒rAd-GP5-2A-M感染HEK-293A细胞的间接免疫荧光抗体染 色结果图
A:感染重组腺病毒的HEK-293细胞，有明显的荧光； B:未感染重组腺病毒的HEK-293细胞，没有荧光； 图10各重组腺病毒DNA转染HEK-293A细胞的western blot分析化学发光图
1:接种rAd-GP5-2A-M的HEK-293A细胞裂解物；
2:接种rAd-GP5-M的HEK-293A细胞裂解物；
3:接种rAd-M的HEK-293A细胞裂解物；
4:接种rAd-GP5的HEK-293A细胞裂解物；
5:接种野腺病毒的HEK-293A细胞裂解物。
具体实施例方式
通过以下实施例将对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不受以下内容所限制。
对有关材料的说明
PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332: GenBank登陆号为PRU87392; FMDV China/99 0型毒株GenBank登陆号为AF506822; PRRSV国内分离株NB/04毒株浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所 动病组实验室分离、保存并提供。
实施例1:(猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗的制备方法)
该疫苗制备按以下步骤进行
(1) GP5-2A-M融合蛋白基因的构建
1.1 PCR弓I物设计合成根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332和FMDV China/99 0型毒株的基因序列，各设计一对针对PRRSV国内分离株NB/04毒株 GP5、 M和2A基因的特异性融合引物，引物序列如下
AdGP5: 5， -CGC G6T紅CCA CCA TGG TGG GGA AAT GCT TG-3' AdGP5-2A: 5' -AAC GTC TCC TGC TAA CTT CAA AAG ATC AAA GTT CGT GAG ACG ACC CCA-3'
AdM-2A:5， -TTA GCA GGA GAC GTT GAG TCC AAC CCC GGA CCC ATG GGG TCG TCT CTA-3'
AdM: 5， -TAT TAT TTG GCA TAT TTA AC-3'
1. 2 NB/04毒株感染Marc-145细胞及总RNA的提取将PRRSV分离株 NB/04接种Marc-145，到细胞病变达80%左右收取细胞，冻融3次；取lml细胞 液，用RNA提取试剂盒(Sangon公司)提取细胞总RNA;
1.3以AdM引物作反转录 取AdM引物1.5 ul，细胞总RNA 10.0 ul， 10mM dNTPsl.5ul， 5x反转录酶缓冲液5.0ul， AMV l.Oul，用DEPC水补加至总体
积25.0 ixl，充分混匀后，置37。C l.Oh，其产物cDNA作为PCR反应的模板；
1.4 PCR扩增扩增PRRSV GP5-2A基因，取cDNA2.0ul， AdGP5 l.Oul ， AdGP5-2A 1. 0 u 1， 2. 5raM dNTPs 4. 0 u 1 ，含Mg" 10 x ExTaq缓冲液5. 0 ii 1 , ExTaq聚合酶0. 25 u 1 ，用无菌双蒸水补至总体积50. 0 u 1 ;循环参数为94 °C 5min; 94°C lmin, 58。C lmin， 72°C 45s， 30个循环；72°C lOmin;扩增PRRSV M-2A基因，取cDNA2. Oul， AdM-2A1.0nl ， AdM 1. 0u 1， 2. 5mM dNTPs 4. 0u 1 ， 含Mf 10 x ExTaq缓冲液5. On 1 ， ExTaq聚合酶0. 25u 1 ，用无菌双蒸水补至 总体积50. Oul;循环参数为94°C 5min; 94°C lmin， 55°C lmin， 72°C 45s， 30个循环;72°C 10min。融合GP5-2A-M基因，AdGP5 1. 0 " 1， AdM 1. 0 u 1， 2. 5mM dNTPs 4. 0 u 1 ，含Mg" 10 x ExTaq缓冲液5. 0 n 1 ， ExTaq聚合酶0. 25 ti 1 ， 用无菌双蒸水补至总体积50.0u 1 ;循环参数为94°C 5min; 94°C lmin， 55 °C lmin， 72°C 90s， 30个循环；72°C lOmin。 PCR产物进行P/。的琼脂糖凝胶电 泳；
1.5融合PCR产物的克隆通过融合PCR技术，以AdGP5和AdM引物将GP5、 2A和M基因融合为GP5-2A-M融合基因；
1.5.1融合PCR产物回收与纯化融合PCR产物经W琼脂糖凝胶电泳后，在 紫外灯下切下含目的条带的琼脂凝胶，用DNA凝胶回收试剂盒(7afeyfe公司) 回收凝胶中的目的片段，具体步骤见试剂盒说明书；
1, 5. 2融合PCR产物酶切与纯化 10xK Buffer 2. 5y 1， BSA 5. Ou 1， DNA 25.0ul， Kpnl 2.0ul， Notl 2.0ul，用双蒸灭菌水补至总体积50. 0 u 1; 37 °C， 2.0h，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，方法同上；
1. 5. 3 pShuttle-CMV酶切纯化 10xK Buffer 2. 5 ti 1， BSA 5. Op 1， DNA 25.0ul， Kpnl 2.0ul， Notl 2.0ul，用双蒸灭菌水补至总体积50. 0 u 1; 37
°C, 2.0h，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，方法同上；
(2) 穿梭载体pShuUle-CMV- GP5-2A- M的构建
2.1.1目的片段与pShuttle-CMV的连接反应 10xT4 Ligation Buffer 2.5ul，酶切回收DNA lO.OiU，酶切回收pShuttle-CMV载体1.5ul， T4连接 酶l.Oul，用灭菌双蒸水补足总体积25.0ul;混匀后16。C连接过夜，连接产 物转化DH5a，涂卡那霉素(50iig/ml)琼脂平板，37。C过夜培养；
2. 1. 2大肠杆菌DH5 a感受态细菌的制备和转化DH5 a感受态细菌的制备 与转化见分子克隆；
2.1.3重组质粒的提取和鉴定质粒提取应用常规的碱裂解法，提取后的重 组质粒采用PCR和双酶切鉴定，电泳后都可见目的条带；
2.2目的片段序列分析合成一对pShuttle-CMV测序引物(宝生物工程(大 连)有限公司合成)，引物序列为Adseql: 5-GGT ATA TAT AAG CAG AGC TG-3; Adseq2: 5-GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG-3，送宝生物工程(大连)有限 公司进行双向测序；测序结果使用DNAstar软件进行拼接，然后与PRRSV NB/04 毒株的GP5和M基因进行同源性比对，结果所克隆入的基因序列与NB/04毒株同源 性100%，而且其读码框无误；
(3) 穿梭载体pShuttle-CMV- GP5-2A- M与腺病毒载体pAdEasy-l的同源重 组与纯化
3. 1 pShuttle-CMV-GP5-2A-M Pmel线性化与纯化用10xNE buffer4 5. 0 u 1， 100xBSA 0. 5ul， pShuttle-CMV-GP5-2A-M 25. Onl， Pmel 2.0ul，用灭菌双 蒸水补加至总体积50.0ul; 37°C 2. Oh ，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物， 方法同上；
3. 2 pShuttle-CMV-GP5-2A-M电转化含有pAdEasy-l的BJ5183-AD-l感受态细胞取出-8(TC保存的BJ5183-AD-l感受态细胞l支，置冰上缓慢溶化，然后向其 中加入O. lug的线性化pShuttle-CMV-GP5-2A-M穿梭载体，混勾置冰上；取出一 个冰冷的电转杯，将线性化pShuttle-CMV-GP5-2A-M穿梭载体与BJ5183-AD-l感 受态细胞混合物迅速加入电转杯金属板中央，进行电转，电转参数为200Q， 2.5KV， 25yE;迅速取出电转杯，立即加入lml的无菌LB培养基，重悬细胞；随 后将含有细胞的LB转移至离心管中，放入摇床上，37°C lh，转数225-250rpm; 转化的细胞分为50ul , 100ul和850iil涂LB卡那霉素抗性琼脂平板，37。C过 夜培养；
3. 3重组细菌的挑选和质粒提取经过夜培养，挑取平板上的10个最小菌落 接种于3.0ml含卡那霉素的LB培养基中，37°C 225-250rpm过夜培养；使用小剂 量碱裂解法提取10个菌液的质粒，用30u l的双蒸灭菌水重悬质粒；
3.4重组DNA的鉴定
3. 4. 1重组质粒的PCR AdGP5 1. 0 u 1， AdM 1. 0 y 1， 2. 5mM d證s 4. 0 u 1 ， 含Mg" 10 x ExTaq缓冲液5.0ul ， ExTaq聚合酶0.25ul ，用无菌双蒸水补至 总体积50.0ul ，循环参数同上，PCR产物进行iy。的琼脂糖凝胶电泳；
3.4.2重组质粒的酶切10xNE Bufferl 2.0yl， 100xBSA 0. 2ul， Pacl 0.2lil，重组DNA lO.OiU，用双蒸灭菌水补至总体积20.0wl， 37°C 3h，然后 进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，鉴定；
3. 5重组质粒的扩增和纯化将鉴定好的重组质粒pAdEasy-l-GP5-2A-M转 化XL10—Gold感受态细胞，取100ul的XL10"Gold感受态细胞置于冰上；加入 4ul的0-ME混匀，冰浴10min;加入O. 1-50ng的重组质粒混匀，冰浴30min; 42 "C热击30s，冰浴2min;加入预热的NZY+培养基0.9ml，置摇床上，37°C lh，转 数225-250rpm;转化的细胞分为5"1 ， 25 " I和IOO u 1涂LB卡那霉素抗性琼脂
平板，37"过夜培养；挑取一菌落接种于10.0ml的卡那霉素LB培养基中，37°C 振荡过夜培养；取1.0ml过夜细菌培养液接种于100ml卡那霉素LB培养基中，37 。C振荡过夜培养，使用Wizard^ PureFection Maxi Plasimid DNA Purification System提取重组质粒，方法参照试剂盒说明书； (4)重组腺病毒rAd-GP5-2A- M的获得与鉴定
4.1重组pAdEasy-1-GP5-2A-M质粒的线性化 10xNE Bufferl 10. 0ul， 100xBSA l.Oul， Pacl 2.0ul，重组DNA 5.0ug，用双蒸灭菌水补至总体积 100ul， 37°C 3h;取0.2ug的重组DNA进行0.8。/。的琼脂糖凝胶电泳，酶切后使 用宝生物工程(大连)有限公司的核酸共沉剂将DNA沉淀，然后在无菌条件下用 50ul的双蒸灭菌水重悬DNA，置于-2(TC待转染用；
4. 2 HEK293-A细胞的复苏、培养与冻存从液氮灌中取一支冻存的HEK293-A 细胞，置于37"C的水浴锅中轻轻振荡至40-60s;将细胞转入一个无菌的含有 10mlDMEM培养基的离心管中，室温1500rpm，离心5min，弃去上清；加入5ml含 109&FBS的新鲜匿EM培养基，重悬细胞；然后将细胞移入50ml的培养瓶中，置37 °C 5%二氧化碳培养箱中培养，至细胞形成单层；用胰酶-EDTA在室温下消化细 胞l-3min，轻敲细胞瓶壁使细胞脱落；用培养液按需要进行分瓶传代；为了保 存细胞亚型的特殊表型，建立细胞贮存库的细胞融合率需小于50%，把生长良好 处于对数期的细胞完全消化下来，离心，沉淀细胞，弃上清；用少量含10。/。FBS 的DMEM重悬细胞，并进行细胞计数；用50y。DMEM+l(mDMSO+40。/。FBS冻存培养基使 细胞密度达到lxl()6个/ml;用2.0ml的冻存管分装1.0ml的细胞，把冻存管放入冻 存盒中置于超低温冰箱中过夜，然后把冻存管移入液氮罐中保存；
4. 3重组pAdEasy-1-GP5-2A-M线性化质粒转染HEK293-A细胞转染在3mm的 培养皿中进行，在转染前一天向培养皿中接种3-4xl05个HEK293-A细胞；取2支无
菌的1.5ml的离心管，每管中加入250iU的不含双抗和血清的DMEM;将5ug的线 性重组DNA加入一离心管中，混匀；取10u lLipofectamine 2000 (Invitrogen) 加入另一离心管中，混匀，室温孵育5min;然后将两管DMEM合为一管，混匀， 室温孵育20min;在此期间吸取细胞培养皿中的培养基，用PBS洗细胞2次；将含 有转染混合物的DMEM 500ul移入细胞培养皿中，置二氧化碳培养箱中培养6h， 弃培养液上清，加入2ml含双抗和l(F。血清的DMEM，置二氧化碳培养箱中培养 7-10d，每天观察细胞病变；
4.4重组病毒的噬斑纯化在6孔细胞板的每一个孔接种5xl()5个细胞，37°C 过夜培养；将重组病毒原液10倍稀释，稀释所取范围10—5-10—9，体积lml，把各 病毒稀释液加入6孔培养板各孔中，并设一空白对照(不加病毒)，37°C 2h;弃 各孔培养液，每孔加入3ml 1.25。/。低融点胶/DMEM混合液，37°C培养12-21d，观 察噬斑；用灭菌枪头挑取白色噬斑的琼脂糖块，放入无菌离心管中，加入200ul 的灭菌PBS，将琼脂糖块捣碎后反复冻融3次；12000rpm离心10min;收获的病毒 接种一新的6孔板中；
4. 5 IFA检测重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的表达重组腺病毒接种HEK-293A 细胞后24h，弃去培养液，用PBS洗涤细胞；加入冷丙酮，4t:固定30min ;弃去 丙酮，PBS洗涤3次；将鼠抗PRRSV GP5、 M蛋白单克隆抗体(哈尔滨兽医研究所 赠送)分别作1:50稀释，每孔加入50ul，在湿盒内37。C温育30min;移去稀 释血清，用PBS洗涤3次；每孔加入50tU的l : 100稀释的FITC标记羊抗鼠IgG， 在湿盒内37'C温育30min,用PBS洗涤3次；吹干后滴加加碱性甘油，于荧光显微 镜下观察；
4.6 Western blot检测聚合蛋白GP5-2A-M的表达与裂解将感染重组腺病 毒的细胞裂解液通过12yoSDS-PAGE电泳分离蛋白，采用半干转移(Bio-Rad)转
印硝酸纤维膜，并设细胞裂解液做为空白对照；用含5呢脱脂乳的PBST封闭过夜， 以混合的GP5和M蛋白的单克隆抗体为一抗，1:1000稀释，室温孵育lh;辣根过 氧化物酶标记的兔抗鼠IgG为二抗，1:100000稀释，室温孵育lh;用增强型化学 发光底物(SuperSignal West Pico Kit, PIERCE)作用后转印X光片； (5)重组腺病毒的扩繁
5. 1将步骤(4)鉴定、纯化后的重组腺病毒rAd-GP5-2A- M在HEK-293A细 胞内连续传代30次，其中，每5代检查一次重组腺病毒对6 5-2六-M融合蛋白基 因的转录、表达与裂解质量；
5.2重组腺病毒rAd-GP5-2A-M的病毒滴度测定按常规方法，将病毒裂解 液作10倍比稀释，接种96孔HEK293-A细胞板中，每个稀释度接种8个孔，37°C 培养5d ,计数每个稀释度的CPE数，按Reed-Muench法计算病毒滴度，效价值 力1G10.43 TGIDM/l.()ml;
5.3小鼠免疫试验取6周龄雌性小鼠54只，分为6组，每组9只，每组分别 皮下免疫rAd-GP5-2A-GP6、 rAd-GP5-M、 rAd-GP5、 rAd-M、 wtAd和PBS ，剂量为 0.5mL/只，共免疫3次，每次间隔2周，第三组为PBS对照组；加强免疫后分别于 2周、4周和6周采血测定中和抗体；
5.4中和抗体检测将待检血清56。C灭活30min， 2倍倍比稀释后(1:2 1:256)加入96孔细胞培养板中，每孔50ul;然后加入等体积的病毒液PRRSV NB/04(200TCID5。/100ul)混合，与37。C孵育lh;然后接种已长满单层Marc-145 细胞的96孔培养板中，每个稀释度4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔，37°C 5%0)2培养4 5山逐日观察CPE情况，当病毒对照孔均出现CPE，以抑制50y。CPE 的最高血清稀释度作为中和抗体滴度；
5.5T细胞增殖反应检测无菌取首免后第4周免疫小鼠脾脏，用淋巴细胞
分离液分离淋巴细胞，用含10% FCS的RPMI-1640完全培养基悬浮细胞，使细胞 浓度为5X 106个细胞/ml，分离出的鼠脾淋巴细胞接种至96孔细胞培养板中， 100 u 1 /孔;以纯化灭活的PRRSV NB/04作为刺激抗原100ul /孔，各3复孔； 以加未感染PRRSV NB/04的Marc-145细胞裂解液对照阴性孔，而以加PHA作为阳 性对照孔，置37。C 5y。C02培养箱中培养，72h后，于每孔加入MTT (Sigma)，充 分混匀，继续培养4h后终止培养，于lh内测定0D值(570nm)，计算刺激指数(SI)， SI=A/B (A:刺激孔值；B:非刺激孔值)；
上述结果表明，GP5-2A-M融合蛋白在重组腺病毒rAd-GP5-2A-M连续传代过 程中表达及自我裂解稳定，接毒后细胞病变规律，毒价稳定在1(T43TCID5。/1. Oml; 中和抗体滴度为1:128;
(6) 二价重组腺病毒疫苗的制备
6. 1用猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制备疫苗将纯化的重组腺病毒 rAd-GP5-2A-M，按101。 TCIDs。量接种于HEK-293A细胞上，连续传代30次，检测并 取用表达稳定，毒价稳定在101。43 TCID5。/1.0ml者；当细胞CPE达80-9(m时收毒， 经反复冻溶3次，离心取上清即获得PRRSV二价重组腺病毒疫苗;
6.2经质检、分装、包装后即成PRRSV二价重组腺病毒疫苗。
权利要求
1、猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗，其特征在于该疫苗可通过在PRRSV GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV2A基因相连接，构建成GP5-2A-M融合蛋白基因，并与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组，将重组病毒DNA经酶切，转染HEK-293A细胞后，得重组腺病毒rAd-GP5-2A-M，经腺病毒纯化、扩增等工艺、步骤，制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。
2、 制备权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗的方法， 其特征在于该方法按以下步骤进行(1) GP5-2A- M融合基因的构建根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332 和FMDV China/99 0型毒株的基因序列，各设计一对针对PRRSV国内分离株NB/04 毒株GP5、 M和2A基因的特异性融合引物，引物序列如下AdGP5: 5' -CGC 6^"6T CCA CCA TGG TGG GGA AAT GCT TG-3' AdGP5-2A: 5' -AAC GTC TCC TGC TAA CTT CAA AAG ATC AAA GTT CGT GAG ACG ACC CCA-3，AdM-2A:5' -TTA GCA GGA GAC GTT GAG TCC AAC CCC GGA CCC ATG GGG TCG TCT CTA-3，AdM: 5' -TAT 6C"6" 6tT TAT TTG GCA TAT TTA AC-3' 以Marc-145细胞增殖NB/04毒株，提取其RNA，以AdM引物作RT;然后以 cDNA产物为模板，应用PCR技术扩增出NB/04毒株含FMDV 2A基因的GP5和M 全基因，再通过融合PCR技术，以AdGP5和AdM引物将GP5、 2A和M蛋白基因 融合为GP5-2A- M融合基因；(2) 穿梭载体pShuttle-CMV- GP5-2A-M的构建在步骤(1 )融合基因GP5-2A-M的GP5的上游和M的下游引物的5'端引入相应的限制性内切酶Kpnl和Notl 酶切位点，通过这两个酶切位点，把GP5-2A-M融合基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5-2A-M融合基因的穿梭载 体pShut 11e-CMV-GP5-2A-M;(3) 穿梭载体pShuttle-CMV-GP5-2A-M与腺病毒骨架载体pAdEasy-1的同 源重组与纯化将步骤(2)鉴定含有GP5-2A- M融合基因的穿梭载体 pShuttle-CMV-GP5-2A-M用酶切、去磷酸化后，电转化至已转入腺病毒骨架载 体pAdEasy-l的BJ5183感受态细菌细胞，进行菌内同源重组；用卡那霉素筛选 获得重组病毒DNA， Pacl酶切鉴定，将其中正确的重组病毒DNA再转化XL10— Gold超级感受态细胞，以纯化重组腺病毒DNA;(4) 重组腺病毒rAd-GP5-2A- M的获得与鉴定鉴定好的重组腺病毒DNA 经过Dpal酶切线性化后，转染HEK-293A细胞内，重组腺病毒DNA在胞内包装 成完整的重组腺病毒rAd-GP5-2A- M;通过噬斑纯化后，采用RT-PCR、 IFA和 Western blot方法检测GP5-2A-M聚合蛋白的基因转录、表达及蛋白裂解；(5) 重组腺病毒的扩繁与检测将步骤(4)鉴定、纯化后的重组腺病毒 rAd-GP5-2A-M在HEK-293A细胞内连续传代30次，其中，每5代检査一次重组 腺病毒对GP5-2A-M融合蛋白基因的转录、表达与裂解质量，同时测定其TCIDs。， 从中筛选出表达稳定，接毒后细胞病变(CPE)稳定，种毒毒价稳定在10ia43 TCID5。/1. 0ml的重组腺病毒，-80。C保存；(6) 二价重组腺病毒疫苗的制备取步骤(5)重组腺病毒，按101Q TCID5。 接种于HEK-293A细胞上，进行扩大病毒培养；当细胞病变达70_90%时，取用长 成的单层HEK293-A细胞收毒，经冻融3次即可获得PRRSV重组腺病毒 rAd-GP5-2A-M疫苗，经质检、分装、包装后即成。
全文摘要
本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法，属于生物疫苗制备技术领域。该疫苗可通过在PRRSV GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV 2A基因相连接，构建成GP5-2A-M融合蛋白基因，并与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组，经酶切后，转染HEK-293A细胞，得重组腺病毒rAd-GP5-2A-M，经纯化、扩增等工艺、步骤制备成二价重组腺病毒疫苗而获得。本发明构建的聚合蛋白GP5-2A-M在表达后即自我裂解为GP5和M蛋白，发挥出GP5的病毒中和与M蛋白的免疫功能；其疫苗效价稳定，毒价在10^10.43TCID₅₀/1.0ml，兼有常规弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性；可在猪繁殖与呼吸综合征的防治工作中推广应用。
文档编号C12N15/62GK101380468SQ20081006312
公开日2009年3月11日 申请日期2008年7月17日 优先权日2008年7月17日
发明者涛 云, 斌 余, 征 倪, 刘光清, 华炯钢, 李双茂, 柳 陈 申请人:浙江省农业科学院