一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法
【专利摘要】本发明公开一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，属于发酵工程【技术领域】。采用自行构建并表达rPoIFNα1的重组大肠埃希菌BL21/pET-32a-rPoIFNα1作为生产菌种，在37℃发酵2~3h后，按每升发酵液一次性添加浓度为50g/L~100g/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后，再32℃培养4~5h结束此过程。本发酵方法可以实现rPoIFNα1的高效表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上，效价高达1×106IU/ml以上，且为可溶性蛋白，避免了包涵体表达需要变复性难题，缩短了生产周期，为rPoIFNα1的工业化生产奠定了坚实基础。
【专利说明】—种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及一种重组猪干扰素α I基因工程菌的高密度发酵方法，属于发酵过程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]干扰素(interferon，IFN)是病毒感染诱导机体产生的一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤的活性。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、Υ三类。α型干扰素在体内外能发挥广谱、高效抗病毒作用的机制主要是抑制病毒蛋白质的合成，并能选择性地作用于受感染细胞，且在使用后无任何药物残留。目前全球已有60多个国家和地区应用人基因工程重组干扰素制剂治疗大约30多种病毒性疾病。
[0003]动物用干扰素的研究目前已得到不少成果，畜牧业生产上的研究及应用已受到高度关注。最早在国内应用于兽医临床的是动物白细胞干扰素，由于这种干扰素需采用生化分离的方法获得，工艺成本高，规模化生产困难等。而基因工程技术的发展为动物用干扰素大量生产提供了新的平台。自1986年Lefevre首次克隆出猪α干扰素(porcineinterferon alpha,PoIFNα )基因以来,迄今已有多种兽用干扰素基因被克隆、表达和进行生物学功能研究。我室采用基因工程技术获得了一种重组猪干扰素α(重组猪α干扰素的制备方法，专利号2008100201804)，临床试用结果表明其可有效治疗猪病毒性腹泻等疾病。
[0004]目前基因工程重组猪干扰素α规模化发酵生产技术存在如下问题:1)表达的猪干扰素α蛋白多是以无活性的包涵体形式存在，必须在纯化过程中增加变复性步骤，既增加了生产成本，又影响了蛋白质生物学活性；2)基因工程重组猪干扰素0表达量低，效价不高难以达到产业化要求。
[0005]本发明以自行构建的重组大肠埃希菌BL21/ PET-32a-rPoIFNa I作为生产菌种，采用本发酵方法，在发酵细菌破碎上清中获得目的蛋白，不产生包涵体，省去了包涵体变性、复性等步骤，最大程度上保证了 rPoIFNa I生物学活性，并采用超滤浓缩技术粗纯蛋白，缩短了生产周期。
【发明内容】
[0006]本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
一种重组猪干扰素a I基因工程菌的高密度发酵方法，包括以下步骤:
(1)种子菌培养:将-18-_20°C保存的工作种子菌的菌种接种种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速215~220r/min，培养温度37°C，初始pH值6.8^7.2，培养时间9.5~IOh ；
(2)发酵:将培养好的种子液按接种量f2%接入发酵罐进行发酵，发酵培养基量为18^22L,即向发酵罐中通入无菌空气，通气量为1.4~1.6L/min,保持发酵罐内的含氧量在10~20%，设定培养温度35~38°C，机械搅拌转速为210~230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制发酵pH在7.0-7.1 ；
(3)补料:发酵2~3h，紫外分光光度仪测定OD600为0.4~1.0后，每隔一小时添加蛋白胨20~l00g，酵母粉l0~40g，葡萄糖5~20g，(NH4)2SO4 1~5g，添加2~4次；
(4)诱导:补料2~3h后，紫外分光光度仪测定0D600为1.0时，一次性添加浓度为50~l00g/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)补料液5-40ml，蛋白胨10_50g，酵母粉l0~50g，甘油20~l00ml，(NH4)2SO4 2~10g，然后将温度调至32°C进行目的蛋白的诱导表达4~6h ；
(5)革兰染色及菌体湿重的测定:诱导表达4~6h后，发酵结束，收集菌液，经革兰染色初步检测菌体形态，并在转速为7000r/min，温度为4°C的条件下离心12~16min后，取菌体沉淀物，测定菌体湿重，范围应在0.0200~0.0250g/ml ；
(6)第一次离心:在转速为7000r/min，温度为4°C的条件下离心13~16min后留取菌体沉淀；
(7)重悬沉淀的菌体:重悬时每100g湿重菌体加1L的1XPBS(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L, Na2HPO4 2.9g/L, KH2PO4 0.2g/L)；
(8)破碎菌体:用机械破碎的方法，破碎时用800bar的压力连续对菌体冲撞3_4遍，经革兰氏染色，检测破菌率达到95%以上；
(9)第二次离心:在转速为12000r/min，温度为4°C的条件下离心14~16min后取上清
液；
(10)超滤浓缩:将第二次离心得到的上清液使用0.22 μ m孔径的膜包进行超滤收集通过膜包的下游液体，再用30kD孔径的膜包进行10倍浓缩，收集未通过膜包的上游液体，即为rPoIFNa I的粗制品。
所述种子培养基的组成为:工业级蛋白胨1-lOg/L，工业级酵母粉1~5g/L，NaCl1~10g/L, ρΗ5.1~7.1。
[0008]所述发酵培养基的组成为:工业级蛋白胨1~10g/L，工业级酵母粉1~5g/L，葡萄糖
0.1-1g/L, NaCl 1~10g/L，甘油 0.1~3.33ml/L,消泡剂 0.01-0.33ml/L。
[0009]本发明的优点是:
本发酵方法可以实现rPoIFNa 1的高效表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上，效价高达1 X 1061U/ml以上，且为可溶性蛋白，避免了包涵体表达需要变复性难题，缩短了生产周期，为rPoIFNa 1的工业化生产奠定了坚实基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1:发酵结束的工程菌菌液革兰染色结果(X1000)
图2:工程菌菌液破碎后革兰染色结果(X1000)
图 3: rPoIFNa 1 SDS-PAGE 检测结果 M:蛋白分子标准；
泳道1:本工艺发酵生产rPoIFNa 1I工程菌总蛋白；
泳道2:本工艺发酵生产rPoIFNa 1工程菌包涵体蛋白；
泳道3:本工艺发酵生产rPoIFNa 1工程菌细菌破碎上清蛋白；泳道4:BL21空菌总蛋白对照。
【具体实施方式】
[0011]实施例1
(1)种子菌培养:将-20°C保存的工作种子菌的菌种接种种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220r/min，培养温度37°C，初始pH值7.1，培养时间IOh ；
(2)发酵:将培养好的种子液按接种量1%接入30L发酵罐进行发酵(发酵培养基量20L)，即向发酵罐中通入无菌空气，通气量1.5L/min,保持发酵罐内的含氧量在10~20%，设定培养温度37 °C，机械搅拌转速为220r/min，流加3mol/L氨水控制发酵pH在7.0~
7.1 ；
(3)补料:发酵2~3h，紫外分光光度仪测定OD6tltl为0.4~1.0后，每隔一小时添加蛋白胨20~100g，酵母粉10~40g，葡萄糖5~20g, (NH4) 2S04 I~5g,添加3次；
(4)诱导:补料2~3h后，紫外分光光度仪测定OD6tltl为1.0时，一次性添加浓度为50~100g/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)补料液5~40ml，蛋白胨10~50g，酵母粉10~50g，甘油20~100ml，(NH4)2SO4 2~10g，然后将温度调至32°C进行目的蛋白的诱导表达4~6h ；
(5)革兰染色及菌体湿重的测定:诱导表达4~6h后，发酵结束，收集菌液，经革兰染色初步检测菌体形态(如图1所示)，并在转速为7000r/min，温度为4°C的条件下离心15min后，取菌体沉淀物，测定菌体湿重，范围应在0.0200~0.0250g/ml ；
(6)第一次离心:在转速为700 0r/min，温度为4°C的条件下离心15min后留取菌体沉
淀；
(7)重悬沉淀的菌体:重悬时每100g湿重菌体加IL的IXPBS(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L, Na2HPO4 2.9g/L, KH2PO4 0.2g/L)；
(8)破碎菌体:用机械破碎的方法，破碎时用800bar的压力连续对菌体冲撞3遍，经革兰氏染色，检测破菌率达到95%以上(如图2所示)；
(9)第二次离心:在转速为12000r/min，温度为4°C的条件下离心15min后取上清液；
(10)膜包超滤浓缩:将第二次离心得到的上清液使用0.22 μ m孔径的膜包进行超滤收集通过膜包的下游液体，再用30kD孔径的膜包进行10倍浓缩，收集未通过膜包的上游液体，即为rPoIFNa I的粗制品。
[0012](ll)rPoIFNa I粗制品的总蛋白含量的测定:采用Lowry法测定总蛋白含量为
4~5mg/ml ；
(12)rPoIFNa I粗制品的目的蛋白含量测定:采用非还原性SDS-PAGE电泳法测定目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上(如图3所示)；
(13)rPoIFNa I粗制品的效价测定:
材料:rhIFN a I国豕标准品:购自中国食品药品检定研究院，干扰素ct I国豕标准品；细胞:人传代羊膜细胞(WISH)和人喉癌传代细胞(Hep-2)均由中国科学院上海细胞所提供；病毒:攻击病毒为水疱性口炎病毒(VSV)。
[0013]测定方法:微量细胞病变抑制法，用rhIFNa I国家标准品为对照，检测出生产的rPoIFNa I粗制品效价可达到lX106IU/ml以上。
【权利要求】
1.一种重组猪干扰素α I基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于包括以下步骤: (1)种子菌培养:将_18'20°C保存的工作种子菌的菌种接种种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速215~220r/min，培养温度36~38°C，初始pH值6.8^7.2，培养时间9.5~IOh ； (2)发酵:将培养好的种子液按接种量1-2%接入发酵罐进行发酵,发酵培养基量为.18^22L,即向发酵罐中通入无菌空气，通气量为1.r1.6L/min,保持发酵罐内的含氧量在.10~20%，设定培养温度37°C，机械搅拌转速为21(T230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制发酵pH在7.0~7.I ； (3)补料:发酵2~3h，紫外分光光度仪测定OD6tltl为0.Π.0后，每隔一小时添加蛋白胨.2(Tl00g，酵母粉l(T40g，葡萄糖5~20g，(NH4)2SO4 I~5g，添加2~4次； (4)诱导:补料2~3h后，紫外分光光度仪测定0D_为1.0时，一次性添加浓度为.5(Tl00g/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)补料液5~40ml，蛋白胨l(T50g，酵母粉l(T50g，甘油2(Tl00ml，(NH4)2SO4 2~10g，然后将温度调至32°C进行目的蛋白的诱导表达4~6h ； (5)革兰染色及菌体湿重的测定:诱导表达4~6h后，发酵结束，收集菌液，经革兰染色初步检测菌体形态，并在转速为7000r/min，温度为4°C的条件下离心12~16min后，取菌体沉淀物，测定菌体湿重，范围应在0.0200^0.0250g/ml ； (6)第一次离心:在转速为7000r/min，温度为4°C的条件下离心13~16min后留取菌体沉淀； (7)重悬沉淀的菌体:重悬时每100g湿重菌体加IL的IXPBS(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L, Na2HPO4 2.9g/L, KH2PO4 0.2g/L)； (8)破碎菌体:用机械破碎的方法，破碎时用800bar的压力连续对菌体冲撞3~4遍，经革兰氏染色，检测破菌率达到95%以上； (9)第二次离心:在转速为12000r/min，温度为4°C的条件下离心14~16min后取上清液； (10)超滤浓缩:将第二次离心得到的上清液使用0.22 μ m孔径的膜包进行超滤收集通过膜包的下游液体，再用30kD孔径的膜包进行10倍浓缩，收集未通过膜包的上游液体，即为rPoIFNa I的粗制品。
2.根据权利要求1所述的一种重组猪干扰素aI基因工程菌的高密度发酵方法方法，其特征在于所述种子培养基的组成为:工业级蛋白胨f 10g/L，工业级酵母粉f5g/L，NaClTlOg/L, ρΗ5.1~7.1。
3.根据权利要求1所述的重组猪干扰素αI基因工程菌的高密度发酵方法方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为:工业级蛋白胨f 10g/L，工业级酵母粉I飞g/L，葡萄糖.0.rig/L, NaCl I~10g/L，甘油 0.1~3.33ml/L,消泡剂 0.θ1~θ.33ml/L。
【文档编号】C12P21/02GK103589769SQ201310526159
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】王明丽, 赵俊, 陈琨 申请人:王明丽, 赵俊