专利名称：一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种噬菌体抗体库及其应用，尤其是一种能检测十六元大 环内酯类农药小分子特异性的抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用， 属于一种利用噬菌体展示技术构建的抗体库并将其用于农药残留免疫测 定的范畴。
背景技术：
痕量农药免疫测定技术是一项目前国内外广泛研究和大量使用的农 药残留筛选测定技术。它集测定的高灵敏性和抗体反应的强特异性于一 体，具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、样品需要量少等优点，在农 药的痕量检测方面取得了丰硕的成果。其中，小分子农药的抗体制备是核 心内容，目前正呈现和快速发展的分子生物学技术相融合的形势。
从天然的或免疫的小鼠脾细胞或杂交瘤细胞提取抗体基因，以改建的
噬菌体为载体构建抗体库，与ELISA法相结合，从已构建的展示库中筛选 具有针对农药小分子半抗原的特异性抗体已成为研发热点，即对农药小分 子半抗原进行设计和改造，合成人工抗原，将抗原包被在酶标板上，然后 加入己构建好的待筛选的噬菌体，根据抗原抗体亲和性的大小，经过吸附 一洗脱一扩增的筛选过程，从而得到针对农药小分子的高亲和抗体。利用 噬菌体展示技术构建的抗体库可用于农药小分子抗体的筛选，或从特异性 较高的偏向性库中筛选具有相同结构的一类小分子抗体。Carlos等1993年 就报道了从半合成抗体库中筛选三种小分子半抗原的高亲和力抗体；Yi Li 等在也在混合小分子抗体库中筛选出阿特拉津，西玛津，异丙隆，2甲4 氯丙酸等四种除草剂小分子半抗原的高亲和力抗体；J.Bricheta等也从构建 的天然抗体库中筛出除草剂2，4-D的抗体。而目前针对十六元大环内酯类 农药具有特异性识别的抗体，并以此构建的抗体库还未见报道。
目前国内外农药免疫检测技术已发展到通用型免疫检测，即制备得到 的共性结构抗体(Generic structure antibody)。该种抗体利用抗体针对某些含有共有基团的农药产生交叉反应，制备一种抗体来检测多种农药，在农 药残留的定性筛选检测中有独特的优势，尤其是针对一类农药品种的定性
捡测。Alococer等用有机磷的通用结构瞵酸做半抗原制备了广谱性的多克 隆抗体，对10种以上的有机磷农药有特异性识别，将其应用于传感器分 析中取得了较好的效果。Goodrow利用均三氮苯类除草剂的通用结构作半 抗原制备的抗体对莠去津、扑草津、扑灭津均有特异性识别。但还没有采 用共性抗体库技术的报道，本研究利用共性结构抗体库筛选的到的抗体其 最低检测限及检测灵敏度较传统的多抗均有一定的优越性。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前利用噬菌体展示技术构建的抗体库中没 有对十六元大环内酯类农药具有特异性识别的抗体，而提供一种新的噬菌 体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前利用噬菌体展示技术构建的抗体库中没 有对十六元大环内酯类农药具有特异性识别的抗体，而提供一种新的噬菌 体抗体库及其在农药残留免疫中的应用。
本发明的目的是这样实现的 一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E 载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于所述的 ScFv基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性 单链抗体。
在本发明涉及的噬菌体抗体库中所述的ScFv基因片段是这样构建
的
a) MILO-BSA免疫Balb/c小鼠后，提取小鼠脾细胞总RNA，以其为 模板，Oiigo(dT)m为引物合成cDNA第一链；
b) 根据设计的多组简并性引物经RT-PCR法分别扩增抗体重链可变区
VH和轻链可变区VL基因；
c) 分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的Vh和VL合并片段为模 板，采用重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension, SOE)将二者拼接成ScFv基因，大小在750bp左右，再分別将等量的VhB和VJ各条引
物混合并以二者为引物进一歩PCR扩增ScFv基因；
将构建的ScFv基因片段与pCANTAB5E载体连接与转化。 在本发明涉及的噬菌体抗体库中ScFv基因片段的核苷酸和氨基酸序
列为
atg gcc gag gtg caa ctt gtt gaa tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg tea ttg 60 Met Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly Ser Leu
15 10 15 20
aaa etc tea tgt gca gcc tct gga ttc sec ttc aat acc tac gcc atg aac tgg gtc cgc 120 Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 21 25 30 35 40
cag get cca gga aag ggt ttg gaa tgg gtt get cgc ata agg agt aaa agt aat aat tat 180 Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg lie Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr 41 45 50 55 60
gca aca tat tat gcc gat tea gtg aag gac agg ttc acc ate tec aga gat gat tea ca_a 240 Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Gin 61 65 70 75 80
age atg etc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa act gag gac aca gcc atg tat tac tgt 300 Ser Met Leu Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 81 85 90 95 100
gtg aga cgt gat cgc ttt gac tac tgg ggc caa ggc sec att etc aca gtc tec teg ggt 360 Val Arg Arg Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr lie Leu Thr Val Ser Ser Gly 101 105 110 115 120
ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec gac att gtg atg act cag 420 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Val Met Thr Gin 121 125 3_30 135 140
tct cca tec tec ctg agt gtg tcei gca gga gag aag gtc act attg age tgc asg tec agt 480 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser 141 145 150 155 160
cag agt eta ttc aac agt gga agt caa aag aac tac ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca 540 Gin Ser Leu Phe Asn Ser Gly Ser Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 161 165 170 175 180
ggg cag cct cct aaa ttg ttg ate tac ggg gca tec act agg gaa tct ggg gtc cct gat 600 Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 181 185 L90 "5 200
cgc ttc sea ggc agt gga tct gga acc gat ttc act ctt acc ate age agt gtg cag get 660 Arg Phe Thr' Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr工le Ser Ser Val Gin Ala 201 205 210 215 220
gaa gac ctg gca gtt tac tac tgt cag gat gac cat agt tat ccs ttt acg ttc ggc teg 720 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asp Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser
221 225 230 235 240ggg aca aag ttg gsa ata aaa cgt gcg gcc gca gaa tga Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg A丄a Ala Ala Glu "
759
241
245
250
该核苷酸和氨基酸序列命名为SEQ ID NO: 1 。
其中，VH基因的核苷酸和氨基酸序列为
stg gcc Met Ala
3aa etc Lys Leu 21
cag get Gin Ala 41
Ala Thr 61
age atg Ser Met
81 gtg aga Val Arg
gag Glu
tcs Ser
CC￡L
Pro
tst Tyr
etc lieu
cgt Arg
101
gtg csg Val Gin 5
tgt gca Cys Ma 25
ggsL sag Gly Lys 45
tat gcc Tyr Ala
65 tat ctg Tyr Leu 85
gat cgc Asp Arg 105
ctt gtt Leu Val
gcc tct Ala Ser
ggt ttg Gly Leu
gat tea Asp Ser
caa atg Gin Met
ttt gac Phe Asp
60
120
180
gaa tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg tea ttg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly Ser Leu
10 15 20
gga ttc acc ttc aat acc tac gcc atg aac tgg gtc cgc Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 30 35 40
gaa tgg gtt get cgc ata agg agt saa agt aat sat tat Glu Trp Val Ala Arg lie Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr 50 55 60
gtg aag gac agg ttc acc ate tec aga gat gat tea csa 240 Val Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Gin
70 75 80
aac sac ttg aaa act gag gac aca gcc atg tat tac tgt 300 Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
90 95 tsc tgg ggc caet ggc acc stt etc eca gtc tec teg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr lie Leu Thr Val Ser Ser
100
357
110
115
该核苷酸和氨^i
Vl基因的核昔酸
陵序列命名为SEQIDNO: 2;
和氨基酸序列为
gac a±t Asp工le
atg sgc Met Ser 21
tgg tac Trp Tyr 41
gsi3 tct Glu Ser 61
stc sgc 工le Ser 81
ccs ttt Pr:o Phe 101
gtg Val
tgc Cys
cag Gin
ggg
agt Sec
3tg Met
aag L ys
cag Gin
gtc
gtg
see
Thr
cag Glu
acg ttc Thr Phe
tec Sei: 25
Lys 45 cct Pro 65 csg Gin 85
ggc teg Gly Ser 105
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Pro
ga_t ASp
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tct cca Ser Pro
cag agt Gin Ser
ggg cag Gly Gin
cgc ttc Arg Phe
gaa gac Glu Asp
ggg aca Gly Thi:
tec Ser
eta Leu
cct Pro
Thr
tec Ser 10 ttc Phe 30 cct Pro 50 ggc Gly 70 ctg gca Leu Ala 90
aag ttg Lys Leu 110
ctg agt gtg tea Leu Ser Val Ser
aac agt gga agt Asn Ser Gly Ser
sets ttg ttg 3tc Lys Leii Leu lie
agt gga tct gga Ser Gly Ser Gly
gtt tac tac tgt Val Tyr Tyr Cys
gaa ata aaa cgt Glu lie Lys Arg
gca gga gag aag gtc act Ala Gly Giu Lys Val Thr 15 20 caa sag站c tac ttg gcc Gin Lys Asn Tyr Leu Ala 35 40 tac ggg gca tec act agg Tyr Gly Ala Ser Thr Arg 55 60 sec gst ttc set ctt sec Thr Asp Phe Thr Leu Thr 75 80 cag gat gac cat agt tat Gin Asp Asp His Ser Tyr 95 100
60
120
180
240
300
342该核苷酸和氨基酸序列命名为SEQIDNO: 3。
在本发明涉及的噬菌体抗体库中所述的分别以近等摩尔量的所有引 物扩增条带的Vh和VL合并片段为模板是指将12条引物扩增的Vh基因 产物合并作为一个模板，将11条引物扩增的V!^基因产物合并作为一个模
板；所述的VlB和VHF引物含部分Linker序列，所述的VJ引物含Notl 酶切位点，所述的VHB引物含Sfil酶切位点。
在本发明涉及的噬菌体抗体库中所述构建的ScFv基因与 pCANTAB5E载体连接是指将纯化定量后的ScFv基因分别以Sfil和Notl 内切酶进行双酶切消化；纯化、定量后与同样双酶切pCANTAB5E载体连 接；所述的转化是指a) 0.2cm电转杯，25 (oF， 2.5 kV ， 200Q的电转条 件转化感受态大肠杆菌TG1; b)转化产物加入2xYT后37'C振荡培养2 h, 10倍梯度稀释将菌液涂布于SOBAG琼脂板上，30。C过夜培养；c)次日 计算平板上的克隆数，估算库容为2.4X106; d)将电转化后菌液加入辅助 噬菌体M13K07超感染，离心沉淀菌体，用2xYT-AK重悬，37"C振荡过 夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为ScFv噬菌体表面展示文库。
一种如本发明所述噬菌体抗体库在农药残留免疫中的应用，其特征在
于
a)用十六元大环内酯类农药的抗原包被固相筛选ELISA板，洗涤，加 封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体； 加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体 M13K07超感染；重复以上筛选步骤，共进行四轮"吸附-洗脱-扩增"富集筛 选；
b)将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于培养板上培养过 夜，挑取96个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔 中分别转移菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体M13K07超感 染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。离心取上清进行 ELISA检澳ij，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A45onm-A65()nm计算每孔 吸光值；当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株；
c) 将阳性单克隆噬菌体感染非抑制型ExoliHB2151细胞在含IPTG和 Amp的2xYT培养基中培养，其上清中富含抗体分子，获得可溶性单链抗体；
d) 表达的可溶性单链抗体对a步骤中抗原相对应的十六元大环内酯类 农药具有亲和性。
本发明所述噬菌体抗体库在农药残留免疫中的应用中所述的十六元 大环内酯类农药是指含有十六元大环内酯类共性结构小分子的农药
本发明的优点在于可以不经动物免疫获得高亲和力抗体，试验周期
短，此抗体库以十六元大环内酯共性结构小分子米尔比霉素肟化物为免疫 原构建的噬菌体抗体库，理论上经过筛许可以直接获得十六元大环内酯类 化合物的特异性抗体库，其筛选通量高、效率高、特异性强及亲和选择范 围广，使其在农药抗体制备和检测技术发展等方面具有广泛的应用前景。
图1是在pCANTAB5E载体的Sfil和Notl酶切位点组装ScFv基因片 段的构件示意图2是VH ， Vl, ScFv基因的PCR扩增结果的电泳图3是重组噬菌体载体的PCR鉴定；
图4是MILO标准抑制曲线。
具体实施例方式
实施例1
噬菌体抗体库的构建 材料
噬菌粒pCANTAB5E，五.co/i TG1冻干菌株，M13K07辅助噬菌体均 为Pharmacia公司产品。试剂盒SV Total RNA Isolation System; Reverse Transcription System;各种限制性内切酶，连接酶均购自Promega公司。 免疫原milbemycin oxime (A4、 A3) -BSA (MILO-BSA)实验室保存，雌 性7周龄Balb/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。
引物设计在抗体分子轻、重链框架区FR1和FR4设计多组简并性引物如下所示 并在引物的两端分别加上连接肽(Gly4Ser)3 (Linker)的部分序列和酶切位 点，其中，vj引物含NotI酶切位点，vhb引物含SfiI酶切位点。VhF引物 含部分Linker序列，vlb引物含部分Linker序列，两个Linker序列有21个碱 基序列相重叠。
VLB引物(含部分Linker序列) 5，-tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec GAC ATT GTG MTM ACT CAG TC画3，；
5，-tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec GAC ATT CAG ATG AYD CAG TC-3，；
5，-tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec GAC ATT GWG CTS ACC CAA TC-3，；
5，画tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec GAC ATT GTG ATG ACB CAG KC画3，；
5'-tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC-3，；
5，-tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec GAY ATT MAG ATR AMC CAG TC-3，；
5，匿tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec GAY ATT GTT CTC AWC CAG TC-3，；
5，-tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT漏3'。
vlf引物(含Notl酶切位点) 5 ，-cag tea加tgc ggc cgc ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG-3'; 5'画cag tea ttc tgc ggc cgc ACG TTT TAT TTC CAA CTT TG-3，。
VHB引物(含Sfil酶切位点) 5'-tta etc gcg gec cag ccg gec atg gec GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3，； 5'-tta etc gcg gec cag ccg gec atg gec GAV GTG AWG STG GTG GAGTC-3，；
5，-tta etc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAK GTG CAM CTG GTG GAR TC-3，；
5,-tta etc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAA GTG AAR STT GAG GAR TC-3，； 5，-tta etc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC-3，；
5，-tta etc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTG CAR CTT GTT GAR TC-3'; 5,-tta etc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc CAG GTC CAA CTV CAG CAR CC-3，；
5,-tta etc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTG AAG GTC ATC GAR TC-3，。
VhF引物(含部分Linker序列) 5，-acc gga gcc gcc gcc gcc aga acc acc acc acc CGA GGA GAC TGT GAG AATGGT-3，；
5，-acc gga gcc gcc gcc gcc aga acc acc acc acc CGC AGA GAC AGT GAC CAGAGT-3'。
载体特异性引物(用于连接片段的PCR鉴定) Rl: 5，-CCATGATTACGC CAAGCTTTGGAGCC-3，； R2: 5，-CGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTC C -3，。
以上所有引物均由上海生物工程有限公司合成。
(一) 免疫动物
用免疫原MIOL-BSA免疫5只雌性7周龄Balb/c小鼠，初次免疫， 0.2mg/只，腹腔注射；第4周开始每隔2周进行一次加强免疫，0.2mg/只， 腹腔注射，共4次；最后一次加强免疫后进行冲击免疫，0.4mg/只，腹腔 注射；IO天后处死小鼠取其脾脏。
(二) 提取小鼠脾细胞总RNA，全套VH，VL基因的扩增 提取免疫小鼠脾细胞总RNA，并以总RNA为模板，Oligo(dT)w为引物合成cDNA第一链。根据设计的多组简并性引物扩增抗体重链可变 区(vh)和轻链可变区(VO基因片段，采用多个PCR条件，以使尽可能多的 引物产生扩增条带(参见图2)。
(三) ScFv基因的构建
分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的VH， VL合并片段为模板，采
用重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension, SOE)将二者拼接成ScFv (Single-chain variable fragments)基因。再以VhB合(将等量的VHB各条 引物混合)，VlF ^ (将等量的VlF各条引物混合)为引物进行PCR扩增(参 见图2)，获得大量的ScFv基因。
(四) ScFv基因与pCANTAB5E载体的连接与转化 将纯化定量后的ScFv基因分别以Sfil和Notl内切酶进行双酶切消
化。纯化、定量后与同样双酶切pCANTAB5E载体连接(参见图1)。 0.2cm 电转杯，25 nF， 2.5 kV ， 200Q的电转条件转化感受态大肠杆菌TG1。转 化产物加入2xYT后37'C振荡培养2 h， 10倍梯度稀释将菌液涂布于 SOBAG琼脂板上，30。C过夜培养。次日计算平板上的克隆数，估算库容。 (五)转化子及噬菌体抗体库多样性的鉴定 从平板上随机挑选10个菌落，扩大培养后提取质粒以含有Sfil、 Notl 酶切位点的单链抗体引物&、 R2进行PCR扩增进行鉴定是否含插入片 段(参见图3)。将含有目的基因的质粒交由上海英骏公司测序并与已发表 的序列进行同源性比较。用六碱基内切酶Bamffl与Kpnl对所提质粒双酶 切进行噬菌体抗体库多样性鉴定。
(六)噬菌体单链抗体表面展示文库的构建
用2xYT-AG洗下10块SOBAG平板上所有转化菌落制成悬液，用 2xYT -AG稀释至A600约为0.2，取10 mL 37°C 、250 rpm振摇培养至A600 为0.4，加入辅助噬菌体M13K07超感染，离心沉淀菌体，用2xYT-AK 重悬，37。C振荡过夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为ScFv噬菌体表面展 示文库。
实施例2以米尔比霉素农药为例筛选可溶性单链抗体
(一) 富集筛选MILO-BSA噬菌体抗体
(1) 用4ml纯化MILO-BSA为抗原(100iig/ml)包被免疫管，包被液为PBS (pH7.4)， 4r包板过夜，PBS洗涤免疫管3次，每次5min。
(2) 在免疫管中加满2y。MPBS， 37。C封闭2h。
(3) 去除封闭液，加入扩增的噬菌体抗体，37。C孵育2h。
(4) 去除未结合的噬菌体抗体，PBST缓冲液洗涤免疫管10次(第一轮洗 涤10次，以后每轮洗涤20次)。
(5) lmg/ml胰蛋白酶500W加入免疫管，37。C孵育30min，反复吹打，洗 脱特异性结合的噬菌体抗体。
(6) 50(Vl洗脱液感染3.5ml对数生长期Eco/z' TG1 ， 37。C水浴30min。
(7) 将感染后菌液以10 800g离心5min，去上清，沉淀用lml 2xTY培养 基(含终浓度100pg/mlAmp+P/。葡萄糖)重悬，混匀后铺于TYE培养板上， 37t:培养过夜。次日，TYE培养板上加入2ml2xTY培养基，用玻璃推子轻 刮下所有菌落，混匀。
(8) 取50W菌液加入50ml 2xTY培养基(含终浓度100iig/ml Amp+l。/o葡 萄糖)，250rpm， 37匸振摇培养至0060011111约为0.4。其余菌液加入终浓度15% 甘油，-70°0保存。
(9) 从50ml 2xTY培养基中取10ml，加入5xlO" pfo辅助噬菌体M13K07， 37。C水浴30min， 3 300g离心30min，去上清，沉淀用50ml 2xTY培养基(含 终浓度100ng/mlAmp+50Mg/mlKana+0.1。/。葡萄糖)重悬，250rpm， 30°C 振摇培养过夜。
(10) 3 300g离心15min，收集上清约40ml,加入10ml PEG/Nacl溶液， 混匀后置于冰上1h， 3 300g离心30min，沉淀用2ml PBS重悬，充分混匀。
(11) 10 800g离心10min，取上清约2ml。 lml上清用于下一轮筛选， 剩余约lml上清置于4。C保存。
(12) 重复以上筛选步骤，共进行四轮"吸附-洗脱-扩增"富集筛选。
(二) ELISA鉴定抗MtLO-BSA噬菌体抗体(1) 最后一轮筛选至方法1(6)，得到的细菌稀释后铺于TYE培养板上(含 终浓度100ng/mlAmp)， 37。C培养过夜。
(2) 96孔板中每孔加入2xTY培养基100fi1 (含终浓度100(ig/ml Amp+1% 葡萄糖)，从TYE培养板上随机挑取90个菌落接种于96孔板(剩余6个孔不加 细菌)，250rpm， 37。C振摇培养过夜。
(3) 再取一块96孔板，每孔加入2xTY培养基200^d (含终浓度100pg/ml Amp+P/。葡萄糖)，从第一i央96孔板各孔中分别转移5(J菌液至第二块板， 250rpm， 37'C振摇培养2h。第一块96孔板每孔加甘油至终浓度为15"3/。， -70°C 保存。
(4) 第二块96孔板每孔加入2xTY培养基25nl (含终浓度100ixg/ml Amp + 1%葡萄糖)，每孔再加lxl(^pfii辅助噬菌体M13K07超感染，250rpm， 37°C 振摇培养lh。
(5) 1 800g离心10min，沉淀用200pl 2xTY培养基(含终浓度100pg/ml Amp+50ng/mlKana)重悬，250rpm， 3(TC振摇培养过夜。
(6) 1 800g离心10min，取上清进行ELISA检测。
(7) 用100nl纯化MLO-BSA(100ng/ml)为抗原包被第三块96孔板，包被 液为PBS (pH7.4)， 4。C包板过夜。
(8) PBS洗涤96孔板3次，每孔加满2。/。MPBS， 37tl封闭2h。
(9) 去除封闭液，96孔板每孔加入2，。MPBS150Ml， 90个孔再分别加入 方法5(6)的上清50^d(剩余6个孔不加细菌，加50nl3WBSA作对照)，混匀， 37"C孵育2h。
(10) PBST缓冲液洗涤3次，去除未结合的噬菌体抗体。
(11) 每孔加入1:5 000稀释的HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体， 37。C孵育lh。
(12) PBST缓冲液洗涤3次，每孔加入100pl TMB显色液，室温放置 10min。
(13) 显色清晰后每孔加入50W lmol/L的硫酸终止反应。
(14) 测定每孔450nm和650nm吸光值，按A45o^-A65^计算每孔吸光值。阳性标准为P/N值(Positive/Negative)大于2.1 。 (15)阴性对照为3%BS A替代一抗。 (三)可溶性单链抗体的制备
(1) 取10(il梯度稀释的阳性克隆噬菌体感染20(Vl E.coliHB2151 (OD600 =0.4)宿主菌。
(2) 当OD6Qo值达到0.9时加入IPTG (lmM)诱导其抗体表达，3(TC振 摇培养过夜。
(3) 1 800g离心10min，上清用于抗体分子灵敏度及特异性的测定。 (四)IC-ELISA (间接竞争ELISA)鉴定抗MILO-BSA噬菌体抗体
(1) 用纯化MILO-BSA为抗原(10(^g/ml)包被96孔板，包被液为CBS， 4°C 包板过夜，PBS洗涤96孔板3次，每次5min。
(2) 每孔加满3MBSA， 4"C封闭过夜。
(3) 去除封闭液，每孔加入100W ELISA鉴定阳性的抗MILO-BSA噬菌体 抗体(阴性对照每孔加3。/oBSA 10(^1)， 37。C孵育2h。
(4) PBST缓冲液洗涤3次，每孔加入1:3000稀释的HRP标记的A蛋白， 37。C孵育lh。
(5) PBST缓冲液洗涤3次，每孔加入100pl TMB显色液，室温放置10min。
(6) 显色清晰后加2M H2S04终止反应，450nm下读取吸光值(参见图4)。 以上实施例不是对本发明的具体限制，只要在构建的噬菌体抗体库
中，pCANTAB5E载体的Sfil和Notl酶切位点组装的ScFv基因片段能够 与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体，以及在 将该噬菌体抗体库通过权利要求6的方式与十六元大环内酯类农药的抗原 富集筛选，获得与该农药具有亲和性的可溶性单链抗体，都属于本发明的 技术内容。核苷酸和氨基酸序列表
〈110〉江苏省农业科学院
〈120〉一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用
〈160>3
〈210>1
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15 10 15 20
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gca aca tat tat gcc gat tea gtg aag gac agg ttc acc ate tec aga ga± gat tea caa 240 Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Gin 61 65 70 75 80
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gtg agra cgt gat cgc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc att etc aca gtc tec teg ggt 360 Val Arg Arg Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr lie Leu Thr Val Ser Ser Gly 101 105 UO 115 120
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〈210〉2
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ProPheTharPheGlySerGly ThrLysLeuGlu工leLysArg
101 105 110
权利要求
1、一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于所述的ScFv基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体。
2、 根据权利要求1所述的噬菌体抗体库，其特征在于所述的ScFv基因片段是这样构建的a) MLO-BSA免疫Balb/c小鼠后，提取小鼠脾细胞总RNA，以其为 模板，Oligo(dT)u为引物合成cDNA第一链；b) 根据设计的多组简并性引物经RT-PCR法分别扩增抗体重链可变区 VH和轻链可变区VL基因；c) 分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的Vh和VL合并片段为模 板，采用重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension, SOE)将二者拼 接成ScFv基因，大小在750bp左右，再分别将等量的VHB和VLF各条引 物混合并以二者为引物进一步PCR扩增ScFv基因；将构建的ScFv基因片段与pCANTAB5E载体连接与转化。
3、 根据权利要求1或2所述的噬菌体抗体库，其特征在于ScFv基 因片段的一条核苷酸和氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，其中，Vh基因核 苷酸和氨基酸序列为SEQ ID NO: 2， VL基因核苷酸/氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。
4、 根据权利要求3所述的噬菌体抗体库，其特征在于所述的分别 以近等摩尔量的所有引物扩增条带的Vh和Vt合并片段为模板是指将12 条引物扩增的VH基因产物合并作为一个模板，将11条引物扩增的Vl基因产物合并作为一个模板；所述的VlB和VHF引物含部分Linker序列， 所述的VlJF引物含Notl酶切位点，所述的VHB引物含Sfil酶切位点。
5、 根据权利要求3所述的噬菌体抗体库，其特征在于所述构建的 ScFv基因与pCANTAB5E载体连接是指将纯化定量后的ScFv基因分别 以Sfil和Notl内切酶进行双酶切消化；纯化、定量后与同样双酶切 pCANTAB5E载体连接；所述的转化是指a)0.2cm电转杯，25 (iF， 2.5 kV ，200Q的电转条件转化感受态大肠杆菌TGI; b)转化产物加入2xYT后37°C 振荡培养2h， IO倍梯度稀释将菌液涂布于SOBAG琼脂板上，3(TC过夜 培养；c)次日计算平板上的克隆数，估算库容为2.4><106; d)将电转化后 菌液加入辅助噬菌体M13K07超感染，离心沉淀菌体，用2xYT-AK重悬， 37。C振荡过夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为ScFv噬菌体表面展示文库。
6、 一种如权利要求1所述噬菌体抗体库在农药残留免疫测定中的应 用，其特征在于a)用十六元大环内酯类农药的抗原包被固相筛选ELISA板，洗涤，加 封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体； 加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体 M13K07超感染；重复以上筛选步骤，共进行四轮"吸附-洗脱-扩增"富集筛 选；b) 将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于培养板上培养过 夜，挑取96个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔 中分别转移5^1菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体M13K07超感 染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。离心取上清进行 ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A45QnnrA650nm计算每孔 吸光值；当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，该菌株为阳性单克隆噬 菌体菌株；c) 将阳性单克隆噬菌体感染非抑制型E.coliHB2151细胞在含IPTG和 Amp的2xYT培养基中培养，其上清中富含抗体分子，获得可溶性单链抗体;d) 表达的可溶性单链抗体对a步骤中抗原相对应的十六元大环内酯类 农药具有亲和性。
7、 根据权利要求6所述的噬菌体抗体库在农药残留免疫测定中的应 用，其特征在于所述的十六元大环内酯类农药是指含有十六元大环内酯 类共性结构小分子的农药。
全文摘要
本发明涉及一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于所述的ScFv基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体，并将其应用于农药残留免疫测定中。其优点是可以不经动物免疫获得高亲和力抗体，试验周期短，此抗体库以十六元大环内酯共性结构小分子米尔比霉素肟化物为免疫原构建的噬菌体抗体库，理论上经过筛许可以直接获得十六元大环内酯类化合物的特异性抗体库，其筛选通量高、效率高、特异性强及亲和选择范围广，使其在农药抗体制备和检测技术发展等方面具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/13GK101289760SQ20081012410
公开日2008年10月22日 申请日期2008年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者余向阳, 媛 刘, 刘贤金, 晓 张 申请人:江苏省农业科学院