专利名称：全人源抗人白介素21单链抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可与人白介素21特异结合的单链抗体。
背景技术：
人白细胞介素21 (humaninterleukin-21， hIL-21)是2000年发现的y链(Yc)家族中的一 种细胞因子。hIL-21能抑制Thl细胞分泌IFN个抑制树突细胞(dendric cells, DCs)抗原递 呈功能，促B细胞分化为浆细胞，提高免疫球蛋白y (immunoglobingamma， IgG)分泌，提 高CD8+T细胞细胞毒性，提高自然杀伤细胞(nature killer cells， NKs)细胞杀伤活性，促Thl7 细胞分泌IL-17和IL-21。由于IL-21提高体液免疫和细胞免疫活性，因此其在炎症与自身免 疫性疾病中存在重要的促疾病发展作用。
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为特征，以慢性多发性
关节炎为主要临床表现的一种自身免疫性疾病。研究表明，在类风湿性关节炎病人滑膜组织
中，滑膜成纤维细胞与滑膜巨噬细胞表达IL-21R， IL-21参与其表型分化与IL-ip、 TNF(x分
泌。研究发现，IL-21R不仅在病人的滑膜组织中表达增加，外周血白细胞、滑液白细胞表面
的IL-21R表达均显著增加。因此，阻断IL-21/IL-21R通路可能是治疗RA的新途径。胶原诱
发关节炎(collagen-induced arthritis， CIA)禾卩佐齐!j诱发关节炎(adjuvant-induced arthritis, AIA)
是实验性RA的代表性模型，对CIA和AIA动物模型分别使用IL-21R-Fc可溶性蛋白
(IL-21R-Fc)，发现CIA明显好转而AIA症状完全消失，这一结果支持了 IL-21阻断剂对于
RA治疗的重要作用。进一步研究发现，在IL-21R-Fc剂量为(100^g/ml)时可以降低50%TNFa
分泌量、57% IL-6分泌量和81%的IL-lp分泌量。
原发性干燥综合症(primary Sjogren's syndrome, pSS)是一种累及分泌腺体的自身免疫
性疾病，病理上表现为唾液腺呈灶性CD4+T淋巴细胞浸润，而且B淋巴细胞高反应性成为其
最突出的免疫学特征之一。研究发现pSS患者血清IL-21水平显著高于正常人水平，且与？
球蛋白、红细胞沉降率呈明显正相关，特别是自身抗体阳性者血清IL-21水平显著高于对照，
表明IL-21在pSS患者体内是促进B细胞增殖的，并在调节免疫球蛋白的产生过程中起重要
作用。而且IL-21在pSS伴腮腺肿痛者明显高于对照，推测在免疫紊乱的pSS患者体内，大
量CD4+T细胞浸润唾液腺体，随着IL-21水平的升高，致使B细胞反应性增高，多克隆B淋
巴细胞激活使体内产生大量器官特异性及非特异性自身抗体并可出现高IgG症，更加剧了自
身免疫反应及腺体内外损伤。pSS并甲状腺功能减退者血清IL-21水平显著高于非甲减。干燥
综合症合并甲状腺病变以自身免疫性甲状腺功能异常为主，都存在异常的体液及细胞免疫。
3甲状腺表现为慢性炎症过程大量Thl细胞因子如IFN-Y、 TNF-a等增多，而pSS患者腺体中 IL-2、 IFN-a表达增加提示亦有类似Thl反应。研究发现IL-21可以上调T-bet基因合成进而 增强Thl细胞免疫反应。以往研究表明pSS患者体内CD8+T细胞数量减少，因而对CD4+T 细胞的抑制功能减弱，表现为CD4+T细胞功能亢进，活化的CD4+T细胞产生的大量IL-21激 活T、 B细胞，促进免疫球蛋白的产生引起腺体及腺体外的损伤。
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种自身免疫性结缔组织病，由 于体内大量致病性自身抗体和免疫复合物造成组织损伤。其中IgGl、 IgG2是在SLE中起关 键致病作用的自身抗体，因此在很大程度上，那些影响B淋巴细胞功能的因素便在SLE中发 挥重要作用。IL-21可增强IgG分泌，对抗IgE的生成，并促进B细胞向浆细胞分化，因此 IL-21可能参与SLE的致病过程。研究发现在SLE病患体内IL-21的表达水平远高于健康人， 对于基因多态性分析也显示IL-21是SLE患病风险的候选指标之一。对狼疮性MRL-Fas(lpr) 小鼠模型使用IL-21R-Fc阻断IL-21后，dsDNA自身抗体和总IgG水平下降，特别是IgGl和 IgG2量显著下降，并且SLE的症状如蛋白尿、IgG肾小球沉淀、肾小球基底增厚、皮肤损伤 都有所减少。可见IL-21是SLE —个重要的致病因素，其机制主要是通过影响B细胞的功能 和调节致病性自身抗体数量在SLE中起到致病作用，因此可以推测IL-21阻断剂在治疗SLE 方面具有一定潜力。
非肥胖型糖尿病(nonobese diabetic, NOD)为T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，NOD 小鼠是目前较为常用的糖尿病小鼠模型。研究者绘制出控制这种疾病的基因位点图谱，其中 最重要的位点是ldd3位点，用Idd3保护性等位基因置换NOD小鼠Idd3易感性等位基因能使 糖尿病发生几率下降70% 。 IL-21基因就定位于ldd3，因此IL-21很可能是控制NOD的关键 所在。研究表明和器官特异性自身免疫疾病一样，NOD小鼠的自身免疫性疾病是淋巴细胞减 少症和过量的IL-21导致的自身反应性T细胞代偿性增殖所引起的。实验数据表明NOD小鼠 中表达IL-21受体的T细胞量明显多于含有抗病基因的B6.Idd3.NOD小鼠，特别是记忆型T 细胞是B6.Idd3.NOD小鼠的3-4倍。NOD小鼠IL-2lmRNA的表达量也比B6.Idd3.NOD小鼠 多出数倍，并且IL-21还能上调自身受体的表达，促进IL-21R表达型T细胞增殖，更增强了 应答效应。然而NOD小鼠有大量IL-21R表达型T细胞似乎与淋巴细胞减少症相矛盾，但实 际上尽管IL-21促使T细胞增殖，却并不促进其存活。在NOD小鼠，表达IL-21R的T细胞 更倾向于死亡，存活下来的一部分破坏胰岛P细胞。
实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是T 细胞介导的中枢神经系统(central nervous system, CNS)脱髓鞘疾病，是人类脱髓鞘疾病一 多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)的经典动物模型。研究发现在神经抗原诱导EAE之前使用IL-21,促进了 NK细胞增殖和活性从而增强了 CNS的炎症反应，EAE加剧，但在EAE 产生后使用IL-21却无此效应，NK细胞耗竭可以完全抑制IL-21诱导的病情加重。据此分析， IL-21通过刺激NK细胞介导的炎症反应促EAE病情发展。IL-21与IL-21R基因敲除小鼠中 IL-17的水平低于对照EAE模型组10倍，并且其病情发展缓慢，显示IL-21除了通过刺激 NK细胞介导的炎症反应还通过刺激Thl7细胞分泌IL-17加剧病情发展。
综上所述，此类疾病均出现IL-21异常表达，使得IL-21拮抗剂存在应用于此类疾病的潜力。
抗体相对于化学小分子有其特殊的优势(1)抗体对靶标特异的高亲和力，大大减少了 脱耙所造成的副作用。(2)抗体的半衰期平均为10-21天，从而减少了使用次数，易于被病 患接受。(3)如果靶标不适合使用化学方法处理，抗体可以提供一种新的治疗方式。(4)抗 体有确定的序列，可以通过工程手段更改序列，获得更佳的疗效。
早期鼠源单抗临床试验发现注射鼠源抗体会产生人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibodies, HAMA)显著降低药物体内半衰期，还会增加患者后续应用的临床风险。因此， 鼠源抗体药物的应用受到了限制。随着分子生物学技术的进步，1984年出现了嵌合重组抗体 技术，但是由于嵌合抗体中依然存在33%的鼠源部分，能诱发产生人抗嵌合抗体(Human anti-chimeric antibodies, HACA)反应。随后发展了抗原性更低的人源化抗体(鼠源部分5% 一10%)——通过基因工程手段将鼠源的抗原互补决定区(CDRs)嵌入人抗体骨架中。随着 噬菌体展示技术以及由此衍生的五.Co/z'展示技术、酵母展示技术的发展，使人工合成全人源 抗体成为可能，全人源抗体较前几类抗体免疫原性更低，更加安全。
发明内容
本发明的目的是提供具有潜在医学和药学价值的全人源抗人白介素21单链抗体序列。
全人源抗人白介素21单链抗体基因序列全长750个核苷酸其特征为可变重链区和可变轻 链区组成
可变重链区
CDR1
CDCDR3
可变轻链区
CDR1
CDR2
CDR3 CCGCA
本发明的目的还在于提供一个全人源抗人白介素21单链抗体的筛选方法。 上述发明通过以下技术方案实现。
本发明提供的全人源抗人白介素21单链抗体来源于人源单链抗体噬菌体抗体库，从库中 筛选出与人IL-21有特异性亲和力的抗体序列。
本发明提供的人IL-21筛选方法为
1、 噬菌体抗体库扩增 通过发酵法扩增保存于菌株内的质粒，加入辅助噬菌体释放形成抗体库。
2、 筛选抗人IL-21单链抗体
通过非特异性洗涤去除不与人IL-21作用的噬菌体，通过筛选-富集-筛选的循环获得与 人IL-21具有高亲和力的抗体。
3、 鉴定抗人IL-21单链抗体
使用ELISA鉴定单链抗体的亲和力，使用PCR鉴定插入抗体片断的完整性，使用测序鉴 定抗体的核酸序列。
4、 抗人IL-21单链抗体的可溶性表达
使用HB2151作为表达菌株，用噬菌体直接感染，诱导表达。使用Ni+亲和纯化获得可溶 性单链抗体表达。
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A G本发明提供了 1株对人IL-21具有高亲和力的单链抗体。 本发明提供的抗人IL-21单链抗体可以直接与人IL-21特异性结合。
本发明的全人源抗人白介素21单链抗体有以下优点①与人IL-21的亲和力高；②抗体 序列为全人源，免疫原性低，具有直接开发成人用药物的潜力；③基因工程改造方便，可以 根据CDR区直接合成Fab 二价抗体或完整抗体。
图1人IL-21对免疫细胞的作用。IL-21由多种亚型细胞分泌，其中Thl7细胞与NKT细胞 分泌量远高于Thl和Th2细胞(图中红色箭头)。IL-21可以通过自分泌作用于此类细胞，增 强其正、负反馈作用。
图2亲和筛选每轮洗脱噬菌体滴度。以人IL-21为抗原，对单链噬菌体抗体库进行了四轮亲 和筛选，每一轮筛选后噬菌体抗体收获率呈增长趋势。 图3亲和筛选每轮洗脱噬菌体对人IL-21亲和力ELISA。 图4单克隆噬菌体对人IL-21亲和力ELISA。
图5Ni+亲和柱纯化电泳图。M，分子量Marker; 1，平衡缓冲液冲洗；2， 20mM咪唑冲洗； 3， 50mM咪唑冲洗；4， 100mM咪唑冲洗；5， 200mM咪唑冲洗；6， 500mM咪唑冲洗。单 链抗体在100mM咪唑洗脱。
图6可溶性scFv亲和力ELISA。
具体实施例方式
实施例1全人源抗IL-21单链抗体筛选
1.1制备具有性纤毛的TG1和HB2151
噬菌体通过结合大肠杆菌性纤毛进行感染，将TG1和HB2151从甘油冻存管内平板划线，
接种于M9培养基平板，37'C倒置培养36h。 4'C保存，1周内使用。
1.2野生型M13噬菌体滴度测定 (1)挑取M9平板上的TG1单克隆，接种于2xTY培养基，37。C振荡培养过夜(8~16h)。 (i)取过夜培养的TGl，按P/。(v/v)接种于2xTY培养基，37nC振荡培养至对数期(OD6f0.5)。
(3) 铺下层平板TYE (1.5%琼脂粉)。
(4) 将甘油冻存的野生型噬菌体按IOO倍比例梯度稀释至l(T12，取各个稀释梯度的野生型噬 菌体10nl加入200pl对数期TG1 ， 37'C水浴感染30min。
(5) 将3ml融化后的上层培养基(0.7%琼脂粉)置于42。C水浴中保温，加入感染后的TG1，颠倒混匀，迅速铺于下层平板上，等待上层培养基凝固后，将平板倒置于37'C培养箱培养过 夜。
(6)计数每个平板上的噬菌斑个数，推算原始管内噬菌体的数量。 1.3大量制备辅助噬菌体
(1) 挑取1.2中单个噬菌斑接种到51111处于对数期的丁01培养物中，37。C摇床培养2h。
(2) 转接到含有500ml2xTY液体培养基的2L摇瓶中，继续培养lh，然后加入50mg/ml卡 那霉素水溶液，至终浓度50 70pg/ml，继续培养8 16h。
(3) 10800g， 4。C离心15min，收集上清，加入1/5体积PEG/NaCl (20%PEG， 2.5mol/LNaCl)， 冰上放置大于30min。
(4) 再次10800g， 4'C离心15min，沉淀重悬于2mlTE缓冲液中，0.45nm膜过滤除菌。
(5) 按1.2中方法测定噬菌体滴度，将其稀释至lxl(^p.f.u/ml。分装后置4'C保存备用。 1.4从噬菌体抗体库中筛选功能抗体分子
1.4.1扩增噬菌体抗体库
(1) 取lml保存的噬菌体抗体库(大约lxl01Qp.f.u)接种到500ml 2xTY培养基中(含有 100吗/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖)。
(2) 37。C摇床培养到对数期(OD,为0.4 0.6)，大约用1.5 2h。
(3) 取25ml培养液(大约"10|()个细菌)，用辅助噬菌体VCS-M13感染。感染比例为细菌 数/辅助噬菌体数=1/20。其余475ml培养物按照操作1.4.2制作次级噬菌体抗体库。细菌计算 方法为1 OD6oo细菌培养液约为8xl()8个细菌/ml。
(4) 于37。C水浴中，静置30min。
(5) 3300g， 4'C离心10min，将沉淀重悬在30ml 2xTY培养基中(含有100吗/ml氨节青霉 素和25吗/ml卡那霉素)。
(6) 将上述菌液添加到470ml已经37'C预温的2xTY培养基中(含有100pg/ml氨苄青霉素 和25ng/ml卡那霉素)，3(TC摇床培养过夜。
(7) 10800g， 4。C离心10min或3300g， 4。C离心30min。
(8) 收集上清，加入1/5体积PEG/NaCl (20%PEG， 2.5mol/L NaCl)，彻底混合后4°。放置 lh。
(9) 再次10800g， 4。C离心10min，沉淀重悬于40ml水和8ml PEG/NaCl (20%PEG， 2.5mol/L NaCl)。
(10) 10800g， 4'C离心10min或3300g， 4。C离心30min，吸弃离心上清。
(11) 再次重悬沉淀，再次10800g， 4。C离心10min，彻底吸弃上清。(12) 将沉淀重悬于5mlPBS中，H600g，离心10min，去除细菌碎片(沉淀)。
(13) 噬菌体上清4'C短期保存；用含15。/。甘油的PBS于一7(TC长期保存。
(14) 测定噬菌体保存液的噬菌体滴度。取1^1噬菌体保存液稀释在lmlPBS中，从中取1^1 感染lmlTGl菌液(OD6oo为0.4 0.6)。将感染菌液梯度稀释后，再分别取5(^1感染菌液(原 液、1/102稀释液、1/104稀释液)铺TYE平板(含有100ng/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖)，37°C 培养过夜。噬菌体保存液的滴度应该在1()W l(^p.f.u/ml之间。
1.4.2制备次级噬菌体抗体库
(1) 将1.4.1 (2)步骤中，剩余的475ml培养液继续在37'C摇床培养2h。
(2) 3300g, 4。C离心30min，弃沉淀，将菌体沉淀重悬于10ml 2xTY培养基(含15%甘油)， 分装成10个小管(lml/管)。
(3) 将次级噬菌体抗体库保存在一7(TC。再次使用前，以PCR方法鉴定阳性克隆率及测定 噬菌体滴度。
1.4.3固相亲和筛选
(1) 以包被缓冲液(PBS或50mmol/L NaHC03， pH9.6)稀释人IL-21至100吗/ml。取4ml 加入到免疫管中，室温包被过夜。
(2) 弃上清，以PBS迅速洗管3次。
(3) 免疫管中注满2。/。MPBS， 37。C封闭2h。
(4) 弃封闭液，用PBS迅速冲洗免疫管3次，简单的将PBS倒入免疫管再迅速倒出，以下 洗涤操作相同。
(5) 将1.4.1 (13)步骤获得的噬菌体(1012 1013p.f.u)悬浮于4ml 2% MPBS (含有2%脱 脂牛奶的PBS)并加入到免疫管中。室温反复倒转30min后，于室温静置90min以上，弃上 清。
(6) 在进行第一轮筛选时，以含有0.1% Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次 去除去污剂。第二轮以后的筛选，分别洗管20次。
(7) 将PBS吸干以后，加入lml簡mmol/L三乙胺[700^il三乙胺(7.18mol/L)加入到50ml 水中]，室温反复倒转孵育10min，进行特异性洗脱。
(8) 在孵育过程中，准备0.5ml lmol/L Tris (pH7.4)用于迅速中和(7)特异洗脱下来的噬 菌体。中和后的噬菌体可以直接4'C保存或用于(10)感染TG1菌。
(9) 向免疫管中加入200(xl lmol/LTris (pH7.4)中和残余的噬菌体。
(10) 取9.25ml处于对数期的TGl细菌培养物与0.75ml洗脱下来的噬菌体混合，另外向免
疫管中加入4ml处于对数期TG1细菌培养物。两者同时37'C水浴静置30min。(11) 从两种已感染噬菌体的TG1细菌培养物中分别取10(Hd，并分别做4 5次100倍系列 稀释，然后将梯度稀释物的噬菌体涂布TYE平板(含有100pg/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖)， 37。C培养过夜。
(12) 剩余的两种已感染噬菌体的TG1细菌培养物3300g， 4'C离心10min，菌体沉淀重悬于 lml2xTY培养基中，使用Nunc Bio-Assay Dish铺大型TYE平板(含有lOO^ig/ml氨苄青霉 素和1%葡萄糖)。
(13) 3(TC培养过夜或直至出现可见克隆。 1.4.4进一步亲和筛选
(1) 向长满细菌克隆的Nunc Bio-Assay Dish平板中加入5ml含有15%甘油2xTY培养基并 用玻璃涂布棒刮取细菌并收集菌体悬液。取lOOpl菌体悬液加入到100ml 2xTY培养基中(含 有100吗/ml氨苄青霉素和in/。葡萄糖)，检测其OD6oc^0.1。其余的菌体悬液于一7(TC保存。
(2) 37。C摇床培养至OD6(X)-0.5 (约2h)。
(3) 加入辅助噬菌体VCS-M13感染，感染比例数为细菌数/辅助噬菌体数=1/20。
(4) 37。C水浴静置30min。
(5) 将菌液3300g， 4。C离心10min，菌体沉淀重悬于50ml 2xTY培养基中(含有100吗/ml 氨苄青霉素和25ng/ml卡那霉素)。3(TC摇床培养过夜。
(6) 取40ml过夜培养物，10訓g， 4'C离心10min或3300g， 4。C离心30min。
(7) 收集上清，加入l/5体积PEG/NaCl (20%PEG， 2.5mol/L NaCl)，彻底混合后4。C放置 lh以上。
(8) 再次10800g， 4r离心10min，沉淀重悬于40ml水和8ml PEG/NaCl。
(9) 10800g， 4。C离心10min或3300g， 4'C离心30min，吸弃上清。
(10) 沉淀重悬于2mlPBS中，11600g， 4'C离心10min，尽量去除细菌碎片。
(11) 取lml噬菌体4'C保存，另lml噬菌体用于下一轮亲和筛选。
(12) 重复1.4.3、 1.4.4，进行4轮筛选。
结果以人IL-21为抗原，对单链噬菌体抗体库进行了四轮亲和筛选，每一轮筛选后噬菌体抗 体收获率呈增长趋势，见图2。
实施例2筛选鉴定
2.1多克隆噬菌体ELISA
(1) 将人IL-21用PBS稀释至10pg/ml，每孔添加10(^1，室温包被过夜。
(2) 以PBS洗板3次，用200nl3。/。BSA (PBS配置)封闭2h。
(3) 以PBS洗板3次。每一轮筛选后，取10pl PEG/NaCl沉淀获得的噬菌体，用3%BSA-PBS稀释到ioow，加入酶标板。
(4) 室温孵育90min，以含有0.05%Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。
(5) 每孔加入100^1用3% BSA 1:1000稀释后的羊抗M13多克隆抗体，室温孵育90min。以 含有0.05%Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。
(6) 加入100pl用3% BSA 1:5000稀释后的HRP-兔抗羊IgG多克隆抗体，室温孵育90min。 以含有0.05%Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。
(7) 配置底物液。100吗/mlTMB。底物缓冲液为100mmol/L乙酸钠，pH6.0，每50ml缓冲 液加入10^130%过氧化氢。
(8) 每孔加入lOO^il底物液，室温孵育10min。
(9) 每孔加入5(Hil稀硫酸(O.lmol/L)终止反应。
(10) 测定OD65Q和OD45Q，并以OD45Q的值减去OD65()的值，作为最后检测结果。 结果以样品孔的OD45o值绘制柱状图，每一轮筛选过后亲和力逐渐升高，见图3。 2.2单克隆噬菌体ELISA
(1 )将第4轮筛选获得的平板上挑取单克隆到96孔细菌培养板中，每孔已经添加lOOpl 2xTY 培养基(含有100吗/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖)，37'C摇床(300r/min)培养过夜。
(2) 每孔取出2^1菌液，加入到另一块新的96孔细菌培养板中，每孔已经添加200pl 2xTY 培养基(含有10(^g/ml氨苄青霉素和l。/。葡萄糖)，37。C摇床培养lh。向第一块96孔细菌培 养板的各个孔中加入一定体积的甘油，使甘油终浓度达到15%，然后密封一7(TC保存。
(3) 向第二块96孔细菌培养板的各个孔中加入25pl2xTY培养基(含有100ng/ml氨苄青霉 素和1%葡萄糖)和109p.f.uVCS-M13辅助噬菌体。
(4) 将96孔板在37。C静置30min，然后37。C摇床培养lh。 1800g离心10min，弃上清。
(5) 将菌体沉淀重悬于200pl 2xTY培养基中(含有100|ug/ml氨节青霉素和25吗/ml卡那霉 素)中。3(TC摇床培养过夜。
(6) 1800g离心10min，取100W上清，按照多克隆噬菌体ELISA (参照2.1)的操作进 行检测。
结果以样品孔的OD45o值绘制柱状图，筛选出4个吸光值最高的克隆C4、 El、 Gl、 H9，其 吸光值均》OD舶值的10倍，见图4。经过测序发现C4、 Gl、 El、 H9序列相同。 实施例3抗体可溶性表达与亲和力测定 3.1抗体可溶性表达与纯化
(l)将单克隆ELISA值高于空白3倍以上的孔中的菌吸取1^1接种于lml2xTY培养基，37。C 摇床培养至OD,-0.5。
11(2) 加入辅助噬菌体VCS-M13 37。C感染30min，感染比例数为细菌数/辅助噬菌体数=1/20。
(3) 3300rpm离心10min收集菌体，将菌体沉淀重悬于lml 2xTY培养基中(含有100吗/ml 氨苄青霉素和25pg/ml卡那霉素)中。3(TC摇床培养过夜。
(4) 12000rpm离心10min去除菌体，将离心获得的上清于37。C感染10ml对数期的HB2151 30min。
(5) 将感染后的HB2151 3300rpm离心10min收集菌体，加入5ml含有15%甘油的2xTY培 养基重悬，取10pl涂布含有100pg/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖的TYE平板，37"培养过夜， 剩余的悬液-70'C冻存。
(6) 挑取HB2151单克隆接种于含有100pg/ml氨苄青霉素的2xTY培养基中，培养至对数 期OD6C)(p0.5，加入终浓度为lmM IPTG 30'C摇床培养过夜。
(7) 12000rpm离心10min收集菌体。
(8) 收集的菌体按照每克3ml加入PBS重悬，加入终浓度为lmg/ml的溶菌酶，lmmol/L 的苯甲基磺酰氟化物4度裂解2h， 12000rpm离心20min收集上清。
(9) 将(8)中收集上清0.22pm膜过滤，上于Ni+亲和柱柱床，分别用20mM， 50mM， 100mM， 200mM， 500mM咪唑洗脱。获得电泳纯的融合蛋白可溶性抗人IL-21单链抗体，见图5。 3.2可溶性scFv的ELISA鉴定
(1) 将人IL-21用PBS稀释至10ng/ml， 5pg/ml每孔添加100pd，室温包被过夜。
(2) 以PBS洗板3次，用200nl 3%BSA (PBS配置)封闭2h。
(3) 以PBS洗板3次。取3.1 (9)中获得的可溶性抗人IL-21单链抗体2倍梯度稀释7次，
每孔加入iooni。
(4) 室温孵育90min，以含有0.05%Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。
(5) 每孔加入IOO"I用3% BSA 1:5000稀释后的anti-cmyc tag抗体，室温孵育卯min。以含 有0.05%Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。
(6) 加入脚l用3% BSA 1:5000稀释后的HRP-偶联IgG多克隆抗体，室温孵育90min。 以含有0.05%Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。
(7) 配置底物液。100吗/mlTMB。底物缓冲液为10Ommol/L乙酸钠，pH6.0，每50ml缓冲 液加入1(^130%过氧化氢。
(8) 每孔加入lO(Hil底物液，室温孵育10min。
(9) 每孔加入5(Hil稀硫酸(O.lmol/L)终止反应。
(10) 测定OD65o和OD45o，并以OD45o的值减去OD65o的值，作为最后检测结果。 3.3实施实例所用试剂3.3.1菌株
1) Griffin合成噬菌体抗体库
2) E. coli. TGI: supE hsd △ 5 thi A (lac-proAB) F， [traD36proAB十laclq lacZ A Ml5]
3) E. coli.HB215h K12 ara thi A (lac-proAB) F， [proAB+laclq lacZ △ M15]
4) Wild Type VCS國M 13 3.3.2培养基与缓冲液
1) 2xTY: 16gTyptone， 10g Yeast Extract, 5gNaCl，定容至1L，高压灭菌。
2) TYE: 2xTY添加1.5%琼脂粉，高压灭菌。
3) PBS:称取NaC15.84g， Na2HP04'12H20 11.9g， NaH2P04'2H20 2.64g，溶解于800ml蒸馏 水，NaOH调pH7.2， 121。C高压灭菌20min。室温保存，备用。
4) PEG/NaCl:称取PEG20g， NaCl 14.6g，溶解于蒸馏水定容至100ml， 121'C高压灭菌20min。 室温保存，备用。
5) lmol/L Tris-Cl:称取Tris碱1.21g，溶解于8ml蒸馏水，HC1调pH7.4定容至10ml， 121 'C高压灭菌20min。室温保存，备用。序列表
<110>中国药科大学
<120>全人源抗人白介素21单链抗体
<160>1
<210>1
<212>DNA
<211>750
<213>智人(Homo Sapiens) <400>1
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact agctatggca tgcactgggt gcgccaggtc 120
catgcacaag ggcttgagtg gatgggattg gtgtgeccta gtgatggcag cacaagctat 180
gcacaaaagt tccaggccag agtcaccata accagggaca catccatgag cacagcctac 240
atggagctaa gcagtctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagagaat 300
ccgtctgatc agcgttgtgt ttggggccaa ggtaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt agtgcacttg agattgtgat gacccagact 420
ccactctctc tgtccgtcac ccctggacag ccggcctcca tctcctgcaa gtctagtcag 480
agcctcctgc atagtgatgg aaagacctat ttgtattggt acctgcagaa gccaggccag 540
cctccacagc tcctgatcta tgaagtttcc aaccggttct ctggagtgcc agataggttc 600
agtggcagcg ggtcagggac agatttcaca cagaaaatca gccgggtgga ggctgaggat 660
gttggggttt attactgcat gcaaagtata cagcttctac agactacgtt cggccaaggg 720
accaagctgg aaatcaaacg tgcggccgca 750
1权利要求
1.包含具有序列1的IL-21抗体，所述抗体免疫特异性结合于人IL-21多肽。
2. 包含具有序列1的可变重链区的基因序列的IL-21抗体，所述抗体免疫特异性结合于人 IL-21多肽。
3. 包含具有序列1的可变轻链区的基因序列的IL-21抗体，所述抗体免疫特异性结合于人 IL-21多肽。
4. 权利要求l、 2或3的抗体，其中所述抗体是全人源抗体。
5. 权利要求l、 2或3的抗体，其中所述抗体偶联于可检测物质和治疗剂。
6. 包含权利要求l、 2或3的抗体的诊断试剂盒。
全文摘要
本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及基因工程设计、表达的与人白介素21有特异性亲和力的全人源多肽类单链抗体。此工程抗体多肽是由一条柔性连接肽将抗体的轻链和重链可变区首尾相连而形成的，轻链和重链可变区的骨架与互补决定区均来源于人。本发明通过“富集-洗脱-富集”的循环操作，筛选出对人白介素21具有特异亲和力的抗体，后通过分泌表达系统、亲和纯化系统获得全人源的可以特异性结合人白介素21。本发明抗体可以应用于偶联于可检测物质和治疗剂。
文档编号C12N15/13GK101298480SQ200810124160
公开日2008年11月5日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者娟 张, 弢 张, 李海鑫, 迪 浦, 旻 王, 卫 陈 申请人:中国药科大学