基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用的制作方法

基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用。通过基因重组得到的RMP16，与天然TNF-α相比，在血液中具有更高的稳定性和生理活性，可显著抑制前列腺癌Du145、淋巴瘤Raji、白血病K562、宫颈癌HeLa、乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞的生长，对DU145的抑制效果尤为突出，且可抑制显著Du145细胞移植瘤的生长，其药效学作用与雌莫司汀相似，Du145细胞移植瘤裸鼠，结果显示，重组多肽RMP16的毒副作用明显小于雌莫司汀，无明显的毒副作用表现。该基因重组TNF-α衍生物RMP16可应用于制备具有如下功能的药物：治疗前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤。
【专利说明】基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用

【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，特别涉及一种基因重组TNF- α衍生物RMP16及其制备方法与应用。

【背景技术】
[0002]TNF-α是较早发现的、研究最为深入的肿瘤坏死因子家族成员之一，抗肿瘤作用强，参与多种生理病理过程的调节。人TNF-α为单拷贝基因，定位在第六号染色体上(6Ρ12-13)，与MHC基因群紧密连锁；TNF- α的CDNA大小约2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成。人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，包括由第1、2号外显子编码的76个氨基酸残基的信号肽；切除信号肽后形成非糖基化的成熟的人TNF-α，为157个氨基酸残基，相对分子量为17kDa.。其中第69位和101位为两个半胱氨酸，可形成分子内二硫键，对维持其空间结构有重要意义。
[0003]TNF-α作为一种蛋白类因子，其生物学活性主要是通过和细胞膜上特异受体结合实现的。TNF-α有两种受体，一种是存在于大部分细胞表面的分子量为55_60kDa.的肿瘤坏死因子受体I (tumor necrosis factor receptor I , TNFR I ),另一种是主要存在于造血细胞表面的分子量为75_80kDa.的肿瘤坏死因子受体II (tumor necrosis factorreceptor II, TNFR II)。两类TNFR均为跨膜糖蛋白，氨基酸序列分析显示这两种受体的胞外结构域的序列高度相似，都有保守的富含半胱氨酸的同源氨基酸序列；但是胞内结构域却差异很大，TNFR I胞内段含有死亡结构域(death domain，DD)，而TNFR II没有DD。TNFR I在大多数种类细胞的表面都表达，且大部分生物学功能是由TNFR I介导，包括杀细胞、抗病毒、诱导ICAM-1及IL-6的表达、促进成纤维细胞增殖、激活NF-K B等。TNFRII主要传递胸腺细胞和NK细胞等淋巴细胞的增殖信号，通过促进TNF-α与TNFR I结合而增加TNFR I诱导的作用。根据细胞及其微环境的不同，激活TNFR I后可通过激活不同的信号途径介导细胞增殖、凋亡、坏死性凋亡等程序。
[0004]TNF- α具有很好抗肿瘤作用，被认为是最具潜质的癌症治疗药物。但TNF- α在体内易被肾快速排泄和被各种蛋白酶分解，很不稳定，半衰期较短(15-30min)。若希望达到疗效，则必须频繁注射大剂量TNF-α，进而导致严重的不良反应，甚至引起休克死亡。TNF-a的上述缺陷，严重限制了其实际临床应用，
[0005]研究表明，小分子多肽具有分子量小、活性高、副作用小、无免疫原性、结构简单、易于穿透肿瘤细胞等特点，已成为肿瘤药物研发的新热点。这些都预示着小分子TNF-α衍生物在临床方面将有良好的应用前景。设计高稳定性、高生物活性的TNF-α衍生物，特别是能与血浆中的载体蛋白结合的小分子TNF-α衍生物，可提高其生物利用度，发挥天然TNF-α抗肿瘤的同时，也极大降低了天然TNF-α具有的副作用。具有重要的药用价值和产业化前景。


【发明内容】

[0006]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基因重组TNF-α衍生物RMP16。该衍生物RMP16具有更高稳定性和更高生物活性。
[0007]本发明的另一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法。该制备方法根据TNF-α衍生物RMP16的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计RMP16在原核表达系统的基因序列，采用基因工程技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽RMP16的高效制备；该制备方法生产效率高，生产成本低。
[0008]本发明的再一目的在于提供所述基因重组TNF- α衍生物RMP16的应用。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种基因重组TNF-α衍生物RMP16，其氨基酸序列如下所示:MWQRPSSWIEGRLLTHTISRIAVSYQTKVNLL。
[0010]编码所述的基因重组TNF- α衍生物RMP16的核苷酸序列为:
[0011 ] ATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTGCTGACCCATACCATTAGCCGCATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAATCTGCTG ；
[0012]所述的基因重组TNF- α衍生物RMP16的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)设计并合成RMP16基因:
[0014]采用3条引物两步法合成RMP16基因:
[0015]引物Fl:
[0016]5’-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3’ ；
[0017]引物F2:
[0018]5’-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3’ ；
[0019]引物F3:
[0020]5’-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3’ ；
[0021 ]其中，CATATG 为 Nde I 酶切位点，GCTCTTCCGCA 为 Sap I 酶切位点；GGTGGT 和CCACCAT为保护碱基；
[0022]首先将引物Fl和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以Fl和F3为引物，PCR反应制得RMP16基因；
[0023](2)构建重组载体 pTXBl-RMP16:
[0024]用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pTXBl和步骤⑴制得的RMP16基因进行双酶切，再将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXBl连接，得到重组载体pTXBl_RMP16 ；
[0025](3)制备表达工程菌 pTXBl-RMP16/ER2566:
[0026]用重组载体pTXBl-RMP16转化表达宿主菌大肠杆菌E.coli Strain ER2566，得到表达工程菌 pTXBl-RMP16/ER2566 ；
[0027](4)表达和纯化:
[0028]①诱导表达工程菌PTXB1-RMP16L/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域(Chitin binding domain, CBD)组成的“三元”融合蛋白；
[0029]②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中，然后含有巯基乙醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，反应；巯基乙醇的作用是诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽；然后用洗脱几丁质柱的溶液洗柱，收集洗脱液；
[0030]③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到基因重组TNF- α衍生物RMP16。
[0031]步骤(1)中所述的链延伸反应的条件优选为:94°C，1min ;60°C，5min ;72.C，1min ；
[0032]步骤(1)中所述的PCR反应的条件优选为:94°C，5min ;94°C、30s，60°C、30s，72。。、30s，31 次循环；72°C延伸 1min ；
[0033]步骤⑷②中所述的含有β_巯基乙醇的溶液的组成如下:20mM Tris-HCI,0.5MNaCl，ImM EDTA，50mM β -巯基乙醇，pH 8.0 ；
[0034]步骤(4)②中所述的反应的条件优选为23V反应24小时；
[0035]步骤(4)②中所述的洗脱几丁质柱的溶液的组成优选如下:20mM Tris-HCl, 500mMNaCI，ImM EDTA, pH 8.0 ；
[0036]步骤(4)③中所述的利用高效液相色谱技术纯化目的多肽RMP16的步骤如下:
[0037]A、流动相A为在体积百分比5%乙腈(CNCH3,溶质为纯水)中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1% ;流动相B为100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0.1% ;流速lmL/min，30min线性梯度洗脱；
[0038]B、线性梯度洗脱中流动相B由O~58% (v/v)，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm ;并进行质谱鉴定。
[0039]所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16应用于制备治疗如下疾病的药物:前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤。
[0040]所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16应用于制备治疗TNFR I型受体相关疾病的药物，有如下作用:诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期和抑制肿瘤血管生成等作用。
[0041]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0042](I)本发明所制备的基因重组多肽RMP16，是TNF- α衍生物，与天然TNF- α相比，它具有天然TNF-α的活性中心序列(75~94位氨基酸)，因此具有相似的受体激动性，SP高生物活性；同时，重组多肽RMP16克服了天然TNF-α易被各种蛋白酶分解和代谢的缺陷，稳定性高，可结合血浆载体蛋白，体内半衰期长。
[0043]( 2)基因重组多肽RMP16克服了天然TNF-α由于特定的蛋白结构而存在的副作用，且具有天然TNF- a通过激活受体TNFRI而产生的抗肿瘤作用。
[0044]这些区别使得重组多肽RMP16在生理环境中具有更高的稳定性和对TNFRI受体的激活活性，与TNFRI受体结合后，激活TNF-a信号传导通路，发挥诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期和抑制肿瘤血管生成等作用。
[0045](3)本发明所制备的高稳定性基因重组TNF- a衍生物RMP16在治疗前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性髓原白血病、食管癌等肿瘤中有显著的疗效。
[0046](4)本发明的所述重组多肽RMP16的制备方法效率高、成本低，应用前景广阔。

【专利附图】

【附图说明】
[0047]图1是RMP16基因合成及重组表达质粒pTXBl_RMP16构建示意图；图中:MCS—多克隆位点；CBD—几丁质结合结构域；intein—内含肽。
[0048]图2是SDS-PAGE检测融合蛋白Intein_CBD-RMP16表达的鉴定图；其中，泳道I是IPTG诱导前菌体破碎上清液；泳道2是IPTG诱导后菌体破碎上清液。
[0049]图3是制备的重组多肽RMP16的飞行质谱鉴定图。
[0050]图4为制备的重组多肽RMP16对多种肿瘤细胞的生长抑制作用的检测结果图。
[0051]图5为重组多肽RMP16对Dul45移植瘤生长的抑制作用的检测结果图。
[0052]图6为重组多肽RMP16对治疗裸鼠的肝脏(图6A)、肾脏(图6B)的毒副作用检测的病理切片图。

【具体实施方式】
[0053]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0054]实施例1
[0055]表达工程菌pTXBl-RMP16/ER2566的构建和表达
[0056]具体步骤如下:
[0057](1)RMP16编码序列的获得:
[0058]按照大肠杆菌的密码偏好性设计编码RMP16的cDNA，设计3条引物，采用两步法获得该序列(如图1所示):
[0059]引物Fl:
[0060]5’-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3’ ；
[0061]引物F2:
[0062]5’-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3’ ；
[0063]引物F3:
[0064]5’-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3’ ；
[0065]其中，CATATG为 Nde I 酶切位点，GCTCTTCCGCA 为 Sap I 酶切位点；GGTGGT 和CCACCAT为保护碱基。
[0066]①链延伸反应:
[0067]反应体系为:引物Fl (250 μ M/L) 2 μ L，引物 F2 (250 μ M/L) 2 μ L, 1XTaKaRaBuffer (含有 4mmol/L MgCl2) 2 μ L，dNTP 2 μ L, H2O 11.5 μ L，TaKaRa Taq 酶 0.5 μ L ;
[0068]反应条件为:94°C,1min ;降至 60°C,5min ；72°C, 1min ；
[0069]得到延伸反应液。
[0070]②PCR 反应:
[0071]反应体系为:以延伸反应液为DNA模板，引物Fl (25 μ M/L) 2 μ L，F3 (25 μ M/L) 2 μ L，延伸反应液 1.5 μ L，dNTP 2 μ L，10XTaKaRa Ex Buffer 2 μ L, TaKaRa Taq 酶
0.5 μ L, H2O 10 μ L ；
[0072]反应条件为:94°C,5min;94 °C、30s，60 °C、30s，72 °C、30s，31 次循环；72°C 延伸1min ；
[0073]得到PCR产物。
[0074](2)构建重组载体pTXBl-RMP16，如图1所示:
[0075]用NdeI和SapI进行酶切步骤⑴得到的PCR产物，利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化(根据说明书进行操作)。
[0076]用Nde I 和 BspQ I [Sap I 的同功酶，New England B1labs (NEB)公司】对上一步得到的PCR纯化产物进行酶切。先进行Nde I单酶切，酶切反应体系:DNA (PCR纯化产物)2 μ g，1XNEB Buffer 5 μ L, Nde I 酶(20000U/mL) I μ L，补足超纯水至 50 μ L，37°C 酶切 1.5h;Nde I 单酶切完成后，加入 BspQ I 酶(10000U/mL) I μ L，50°C 酶切 1.5h。
[0077]质粒pTXBl(New England B1labs (NEB)公司)也用 Nde I 和 BspQ I (Sap I 的同功酶)进行酶切，酶切条件同上。
[0078]将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXBl连接，连接体系和连接时间、大肠杆菌DH5CI (购自大连宝生物公司)感受态细胞的制作、转化以及筛选(卡那霉素)，根据《分子克隆》进行操作。将RMP16基因克隆到质粒pTXBl的NdeI和SapI位点间，得到重组载体 PTXB1-RMP16。
[0079](3)表达和纯化:
[0080]①将重组质粒pTXBl_RMP16转化表达宿主菌E.coli Strain ER2566 (New EnglandB1labs (NEB)公司)，得到表达工程菌pTXBl_RMP16/ER2566 ;挑取单克隆于5mL含50 μ g/mL卡那霉素的Luria-Bertani (broth)培养基(简称LB培养基)，摇菌培养过夜,再扩大，以体积比为I: 100的比例接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37°C摇菌至OD600为0.8，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG))至终浓度0.8mmol/L，37°C诱导表达6h。6000rpm离心 20min 收集菌体,将菌体重悬于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCI, ImMEDTA，pH 8.0)中，然后用低温超高压连续流细胞破碎仪进行破碎，破碎条件为=Buffer A溶液稀释菌体的浓度为18% (m/v)，破碎压力为1700bar，制冷温度为4°C。
[0081 ] 破碎产物在4 °C，20000rpm离心30min，收集上清，该上清称为破碎上清液。SDS-PAGE检测融合蛋白Intein-CBD-RMP16的表达，鉴定结果如图2所示。
[0082]实施例2
[0083]重组TNF- α衍生物RMP16的纯化、制备和鉴定
[0084]取20mL几丁质珠(NEB公司产品#S6651L)装填1.5 X 20cm层析柱，以10倍柱体积的Buffer A溶液洗柱；实施例1中的破碎上清液以0.5mL/min的流速上注；用10倍柱体积的Buffer A溶液以2mL/min过柱，以洗去杂蛋白或未亲和结合的融合蛋白，用60mLBuffer B 溶液(20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, ImM EDTA，50mMβ -巯基乙醇，pH 8.0)自然过柱，使β_巯基乙醇均匀分布并浸泡柱内填料，然后封闭进、出口端，上述反应体系在23°C反应24h，以诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽RMP16。用Buffer A溶液洗脱并用洁净的烧杯收集目的多肽溶液，再经高效液相色谱(HPLC)纯化、制备得到纯度为质量百分比96%以上的重组多肽RMP16，目的多肽的制备条件为:流动相A(5% CNCH3:95% H2O,
0.1 % TFA)，流动相B (100% CNCH3,0.1 % TFA)，流速I mL/min，线性梯度洗脱，收集目的多肽洗脱峰，检测波长218nm。目的多肽RMP16的纯度通过分析性HPLC测定(条件同目的多肽的制备条件)。制备的目的多肽RMP16利用质谱技术鉴定(结果如图3所示)，质谱检测分子量为3.786kDa.，与其理论值相符合。
[0085]实施例3
[0086]制备的重组多肽RMP16对多种肿瘤细胞的生长的抑制作用
[0087]前列腺癌Dul45、淋巴瘤Raj1、白血病K562细胞株(均购自美国菌种保藏中心(ATCC))培养于RPM1-1640+10% FBS培养液(美国Gibco公司产品)中。宫颈癌HeLajL腺癌MCF-7细胞株(均购自美国菌种保藏中心(ATCC))培养于DMEM+10% FBS培养液(美国Gibco公司产品)中。所有细胞株均培养在37°C、饱和湿度及体积分数为5%的CO2培养箱中，每隔2~3天换液或传代一次，取对数生长期细胞，以6X 13个/孔接种于96孔板，每孔100 μ L，置CO2培养箱培养24h贴壁后，用一定浓度的药物进行处理48h，每浓度设6复孔，设置实验组、对照组及空白组，倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。处理结束采用CCK-8法进行细胞活力检测，每孔加入10 μ L CCK-8溶液(Yeasen公司)，在培养箱内孵育I~2h (控制对照组细胞的OD值约1.0左右)，酶标仪测定吸光度OD值(波长450nm，参考波长630nm)。
[0088]按下列公式计算药物对细胞的生长抑制率:生长抑制率IR(% ) = [1-(实验组OD值一空白组OD值)/ (对照组OD值一空白组OD值)]X 100%。计算各浓度的抑制率。
[0089]实验结果如图4所示，选取的5株肿瘤细胞株为研究对象，RMP16分别在20μΜ、10μΜ、5μΜ、2.5μΜ、1.25μΜ、0.625 μ M的终浓度下作用48h，检测其细胞生长抑制作用。经CCK-8检测，RMP16对5株人肿瘤细胞的生长均有明显的抑制作用，RMP16具有广谱的抗肿瘤活性，对前列腺癌细胞DU145的抑制效果尤为突出，对应的IC50为17.20± 1.95μ M。对人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞的IC50为228.31 ±35.35 μ M ;对人慢性髓原白血病Κ-562细胞的IC50为150.34±33.54 μ M ;对人宫颈癌HeLa细胞的IC50为44.63 ±2.85 μ M ;对人乳腺癌 MCF-7 细胞的 IC50 为 54.29 ±13.70 μ M0
[0090]实施例4
[0091]重组多肽RMP16对Dul45移植瘤生长的抑制作用
[0092]BALB/c-nu/nu裸鼠【购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号0110231，许可证号:SCXK(粤)2008-0002】，30只，雄性，4周龄，体重17~19g，由暨南大学实验动物管理中心提供SPF级【Specific Pathogen free，许可证号:SYXK (粤)2012-0117】条件饲养，恒定温度(22~24°C )，恒定湿度(50%~70% )，无特定病原体，12h黑白交替，每笼6只；饲养笼、垫料、饲料和水均经高压蒸汽灭菌。隔离一周后，动物生长状况良好，进食进水正常，无异常病态表现。
[0093]取对数生长期的人前列腺癌Dul45细胞，用无血清的RPM1-1640培养基(美国Gibco公司产品)重悬细胞，制备成细胞浓度为1.5X 17个/mL的单细胞悬液。用酒精棉球消毒实验组裸鼠右侧背部皮肤，用ImL注射器于皮下接种Dul45细胞悬液0.2mL (约3 X 16个细胞)/只，余下6只未接种肿瘤细胞，作为空白对照组。接种一周后，裸鼠右侧背部均明显见到瘤体，直径约3mm大小，成瘤率100%。造模成功后，随机分为4组，每组6只，尾静脉注射给药，每天一次，总共给药4周，即:阴性对照组:尾静脉注射0.9% NaCl 0.1mL ；RMP16组:尾静脉注射40 μ M RMP160.1mL0
[0094]用药4周后,处死,剖出肿瘤块,称量瘤重,计算抑瘤率(inhibit1n rate, IR):抑瘤率(IR) = (I 一治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)X 100%。
[0095]实验结果如图5所示，RMP16组对移植瘤的平均抑瘤率为76.11% (瘤重与0.9%NaCl组比较，P〈0.01)，表明RMP16对人前列腺癌Dul45裸鼠移植瘤具有生长抑制作用。
[0096]实施例5
[0097]重组多肽RMP16对治疗裸鼠的肝脏、肾脏的毒副作用检测
[0098]Dul45移植瘤裸鼠分别经重组多肽RMP16、0.9% NaCl> Estramustine (雌莫司汀，临床用于治疗前列腺癌的药物，Phamacia公司)治疗4周后的裸鼠，处死后迅速摘取肝脏和肾脏，以正常裸鼠作为空白对照。摘取的肝脏和肾脏用10%中性Formal in (福尔马林)固定，经乙醇脱水和石蜡包埋后，进行HE染色，染色步骤如下:
[0099]①烘片:60°C烘烤30min ；
[0100]②脱腊:二甲苯I lOmin—二甲苯II lOmin—无水乙醇I 5min—无水乙醇II 5min — 95 % 乙醇 I 5min — 95 % 乙醇 II 5min — 80 % 乙醇 5min —自来水洗 Imin ；
[0101 ] ③染色:苏木素染1min —自来水洗Imin — I %盐酸酒精20s —自来水洗Imin —伊红染1min —自来水洗Imin ；
[0102]④透明:80 %乙醇2min — 95 %乙醇II 2min — 95 %乙醇I 2min—无水乙醇II 2min —无水乙醇 I 2min — 二甲苯 II 5min — 二甲苯 I 1min ；
[0103]⑤固封:中性树胶封片，37 °C烘烤48h。
[0104]实验结果如图6A所示，正常肝细胞以中央静脉为中心，单行排列成板状结构，肝细胞体积大、胞质丰富，肝细胞条索之间为肝血窦。RMP16组与正常组比较，未出现坏死、炎症等异常。而阳性对照Estramustine (雌莫司汀，临床用于治疗前列腺癌的药物，Phamacia公司)组，门管区有较多的炎细胞浸润。
[0105]实验结果如图6B所示，正常肾皮质主要包括肾小球及其周围肾小管，肾小球主要由毛细血管组成，球囊腔清晰可见。与正常组相比，RMP16组肾组织未出现炎症、坏死等现象；而阳性对照Estra mustine组，肾小管腔内管型均质红染，出现透明管型，可能有一定肾毒。
[0106]实验结果表明，重组多肽RMP16的毒副作用明显小于临床用药Estramustine。
[0107]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种基因重组TNF-α衍生物RMP16，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所/Jn ο
2.根据权利要求1所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16，其特征在于:编码所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.权利要求1或2所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)设计并合成RMP16基因: 采用3条引物两步法合成RMP16基因: 引物Fl:
5’-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3’ ； 引物F2:
5’-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3’ ； 引物F3:
5’-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3’ ；
其中，CATATG 为 Nde I 酶切位点，GCTCTTCCGCA 为 Sap I 酶切位点；GGTGGT 和 CCACCAT为保护碱基； 首先将引物Fl和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以Fl和F3为引物，PCR反应制得RMP16基因； (2)构建重组载体pTXB1-RMP16: 用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pTXBl和步骤(1)制得的RMP16基因进行双酶切，再将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXBl连接，得到重组载体pTXBl_RMP16 ； (3)制备表达工程菌pTXBl-RMP16/ER2566: 用重组载体PTXB1-RMP16转化表达宿主菌大肠杆菌E.coli Strain ER2566，得到表达工程菌 PTXB1-RMP16/ER2566 ； (4)表达和纯化: ①诱导表达工程菌PTXB1-RMP16L/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域组成的“三元”融合蛋白； ②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中，然后含有β-巯基乙醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，反应；β-巯基乙醇的作用是诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽；然后用洗脱几丁质柱的溶液洗柱，收集洗脱液； ③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到基因重组TNF-α衍生物RMP16。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中所述的链延伸反应的条件为-MV，1min ；60°C，5min ；72°C，1min0
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤⑴中所述的PCR反应的条件为:94°C,5min ；94°C>30s,60°C >30s, 72°C>30s, 31 次循环；72°C延伸 1min0
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)②中所述的反应的条件为23°C反应24小时。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)②中所述的含有β-巯基乙醇的溶液的组成如下:20mM Tris-HCI，0.5M NaCl，ImM EDTA,50mM^ -巯基乙醇，pH 8.0 ；步骤(4)②中所述的洗脱几丁质柱的溶液的组成如下:20mM Tris-HCl, 500mM NaCI，ImM EDTA，pH 8.0。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)③中所述的利用高效液相色谱技术纯化目的多肽RMP16的步骤如下: A、流动相A为在体积百分比5%乙腈中添加三氟乙酸得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1% ;流动相B为100%乙腈中添加三氟乙酸，TFA的终浓度为体积百分比0.1% ;流速lmL/min, 30min线性梯度洗脱； B、线性梯度洗脱中流动相B由体积百分比O~58%，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm ;并进行质谱鉴定。
9.权利要求1或2所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的应用，其特征在于:所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16用于制备治疗如下疾病的药物:前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宫颈癌、乳腺癌。
10.权利要求1或2所述的基因重组TNF-a衍生物RMP16的应用，其特征在于:所述的基因重组TNF- a 衍生物RMP16用于制备治疗TNFR I型受体相关疾病的药物。
【文档编号】C12N15/70GK104177489SQ201410367873
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】马义, 洪岸, 姜石松 申请人:暨南大学