r>[0049] 在倒置相差显微镜（100X)下定期观察脐带间充质干细胞的形态及其生长增殖 活性。显微镜下观察至细胞呈梭形、成纤维细胞样形态即可。
[0050] (2)流式细胞术检测细胞表面抗原表达特性
[0051] hUC-MSCs经过传代、扩增后，取第3代hUC-MSCs用胰蛋白酶-EDTA消化后用FITC 标记的一抗⑶29、⑶44、⑶105、Oct-4进行孵育，以鼠源IgGl作为阴性对照，用以鉴定该细 胞的抗原表达阳性率。具体步骤如下：
[0052] 1)标本收集：选取3代hUC-MSCs，弃去hUC-MSCs培养基，用PBS平衡盐溶液洗涤 细胞2次，每次5min，洗除残留的细胞培养基；
[0053] 2)每个细胞培养瓶中加入约3ml胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，消化细胞，待细 胞形态变圆、呈漂浮状时，滴加2ml含20% FBS的DMEM培养液终止消化；
[0054] 3)收集细胞，1200rpm，离心5min，弃上清液，收集细胞，用预冷的75%的乙醇固定 细胞30min ;
[0055] 4)然后用PBS溶液洗涤细胞3次，每次5min，洗除残余的固定液；
[0056] 5)在每个流式检测管中加入50 y 1的荧光标记稀释好的一抗（按照产品说明书用 抗体稀释液稀释成合适的浓度）；在空白管/孔或同型对照管/孔中加入50 y 1 PBS溶液；
[0057] 6)每管分别加入100 y 1细胞悬液，细胞量为1-1. 5 X 106,并轻轻混匀；
[0058] 7)室温避光孵育30分钟或4 °C避光孵育过夜；
[0059] 8)每管分别加入2ml PBS平衡盐溶液洗涤未结合的一抗；
[0060] 9)室温避光离心，1500rpm离心5分钟，并弃去上清，反复洗涤细胞3次；
[0061] 10)加入150 y 1荧光素标记的二抗（按照产品说明书适当稀释二抗），37°C，避光 孵育30min ;
[0062] 11)用2ml PBS洗涤细胞一次，1500rpm离心5分钟；
[0063] 12)弃上清后，用PBS溶液制备细胞悬液450 y 1，上流式仪检测，得到的结果如图 1所示。
[0064] 从图1可以看出，hUC-MSCs阳性表达间充质细胞表面标记物抗原⑶29和⑶105以 及胚胎细胞标记物〇ct-4 ;阴性表达造血细胞系标记物⑶45。通过以上细胞表面标记物抗 原鉴定，可以确定从人脐带组织中获得的hUC-MSCs具有扩增活性。
[0065] (3)多向分化诱导实验
[0066] 倒置相差显微镜下观察hUC-MSCs的形态特征，取体外培养、扩增后的3代 hUC-MSCs以1 X 104/cm2密度接种于3个6孔板中进行贴壁培养，待细胞贴壁后，分别加入 骨细胞条件诱导培养基、脂肪细胞条件诱导培养基以及软骨细胞分化诱导培养基，诱导培 养2-3周后分别采用钙钴法-碱性磷酸酶染色、油红-0染色以及免疫组织化学染色鉴定II 型胶原抗体的染色效果。
[0067] 镜下观察骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的形态特征及染色情况。在各个分化诱导培 养组中，均以普通脐带间充质干细胞培养基培养的细胞为阴性对照组。
[0068] 1)成骨诱导鉴定
[0069] 1.待hUC-MSCs达到80?90 %融合时，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞；
[0070] 2.将hUC-MSCs接种于六孔板中，每孔约3 X 103个细胞，每孔中各加入2ml普通脐 带间充质培养液，放入37°C，5% C02孵箱中培养；
[0071] 3. 24h后，移去旧的培养液，加入2ml/孔成骨分化诱导培养液；
[0072] 4.每3天更换1次培养基，诱导2-3周；
[0073] 5. 2-3周后，镜下观察钙结节的形成，钙钴法检测碱性磷酸酶的产生；
[0074] 6.弃去细胞培养板中的骨细胞分化诱导培养基，用PBS溶液漂洗细胞3次，每次 5min，去除残留细胞培养基；
[0075] 7.用10%的多聚甲醛溶液固定细胞；
[0076] 8.用PBS磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，去除残留固定液；
[0077] 9.孵化：一次加入碱性磷酸酶孵化液中的3% 0 -甘油磷酸钠水溶液、2%巴比妥 钠溶液、2%氯化钙溶液、5%硫酸镁水溶液、蒸馏水，按序混合各种溶液后，用10%氢氧化钠 调pH值在9. 0-9. 6之间。固定的细胞孵育前，先将孵育液置37°C温箱预热。细胞固定完备 后，将孵化液加入6孔板中，37 °C下孵化4-6h，自来水冲洗数次。
[0078] 10. 2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗3次。
[0079] 11. 1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固，于显微镜下观察，得到的结 果如图2A所不。
[0080] 其中，孵育液含有以下成分：
[0081]
【主权项】
1. 一种汗腺分化诱导培养基，其特征在于，在低糖DMEM培养基中添加以下成分： 以低糖DMEM培养基的体积计，胎牛血清的体积分数为8-15 %，半琥珀酰氢化可的松 0? 3-0. 5yg/ml，rh-KGF10-100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸 l_3nmol/ml，rh-EGF 10-100ng/ ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0. 05-0. 2ml/ml ; 其中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液包含以下成分：胰岛素〇. 〇lg/L，人转运 铁蛋白 〇? 〇〇55g/L，亚硒酸 0? 000006g/L。
2. 根据权利要求1所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，以低糖DMEM培养基的体 积计，rh-KGF 20_100ng/ml。
3. 根据权利要求1所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，以低糖DMEM培养基的体 积计，rh-KGF 40_100ng/ml。
4. 根据权利要求1所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，以低糖DMEM培养基的体 积计，rh-KGF 40ng/ml。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，以低糖DMEM培 养基的体积计，胎牛血清的体积分数为10%，半琥珀酰氢化可的松0.4 yg/ml，三碘甲状腺 原氨酸2nmol/ml，rh-EGF 10_50ng/ml，优选为rh-EGF 10ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒 酸钠溶液0. lml/ml ; 其中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液包含以下成分：胰岛素〇. 〇lg/L，人转运 铁蛋白 〇? 〇〇55g/L，亚硒酸 0? 000006g/L ;
6. 根据权利要求5所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，所述汗腺分化诱导培养 基还包括：以低糖DMEM培养基的体积计，青霉素90-110U/ml，链霉素90-110 y g/ml ;优选 为青霉素100U/ml，链霉素100 y g/ml。
7. 权利要求1-6任一项所述的汗腺分化诱导培养基在诱导人脐带间充质干细胞向汗 腺样细胞分化中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞采用3-5代细 胞。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，细胞诱导的时间为20-25天，优选为21 天。
10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞以1 X 10 4/孔 的密度接种进行培养； 在培养过程中优选为2-3天更换1次培养基。
【专利摘要】本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种汗腺分化诱导培养基及其应用。该培养基是在低糖DMEM培养基中添加以下成分：以低糖DMEM培养基体积计，胎牛血清体积分数8-15％，半琥珀酰氢化可的松0.3-0.5μg/ml，rh-KGF 10-100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸1-3nmol/ml，rh-EGF 10-100ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.05-0.2ml/ml。该汗腺分化诱导培养基以重组人角化细胞生长因子作为关键调控因子，构建出成品化的汗腺分化诱导培养基，诱导人脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化，结果稳定可靠，可广泛用于多种MSCs向汗腺细胞分化诱导的相关研究及临床应用。
【IPC分类】C12N5-071
【公开号】CN104593320
【申请号】CN201510002902
【发明人】张茂, 许永安
【申请人】许永安, 张茂
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月4日