专利名称：Q热贝纳柯克斯体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法
技术领域：
本发明涉及一种Q热贝纳柯克斯体检测方法，具体地说，涉及一种Q热贝纳柯克斯体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
Q热(Q fever)是由贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)感染所致的一种人兽共患的自然疫源性疾病，该病被国际动物卫生组织(Office International Des Epizooties,0IE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)是Q热的病原体，也是重要的生物战剂和生物恐怖剂，其主要通过呼吸道以气溶胶形式进入体内引起人和动物感染。Q热一般无特异性临床症状，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于Q热感染的早期诊断。由于贝纳柯克斯体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细胞培养等对贝纳柯克斯体病原进行分离。贝纳柯克斯体病原分离操作复杂，费时费力且成功率低。聚合酶链式反应(PCR)是上个世纪90年代发展起来的一种简便、敏感、特异的检测病原体的分子生物学检测方法，也在Q热贝纳柯克斯体感染诊断中应用。目前，贝纳柯克斯体的快速检测与鉴定主要方法有Maurin，Μ.和Raoult，D.的PCR法，研究者根据16SrRNA、ISlllla以及coml、sod与16S rDNA特异性基因设计引物，广泛应用于PCR检测哺乳动物、节肢动物及患者等各种标本的Q热病原体。但是传统的PCR技术在应用中还存在着不足，一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。实时荧 光定量PCR(real-time PCR)则可以结合传统PCR的优点并克服不足，实现检测结果和检测样品之间的定性和定量关系，从而可以根据需要对样品进行准确定量。另夕卜，该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。实时荧光定量PCR最突出的优点就是可以对核酸样品进行精确定量。染料与DNA双链结合时在激发光源的照射下发出荧光信号，其信号强度代表双链DNA分子的数量。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大。未掺入链中的染料不会被激发出任何荧光信号。染料与DNA双链分子的结合是非特异性的，它可以和反应体系中所有DNA分子结合，易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响，使定量结果不可靠。可用熔解曲线分析特异性和非特异性扩增，引物的设计和反应条件的优化对消除非特异性荧光都有很大帮助。目前主要使用的是SYBR Green I和SYBR Gold。一般的染料法灵敏度低，特异性不强。SYBR Green I是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强，且其荧光强度的增加与双链DNA的数量成正比。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。在扩增体系中直接加入Power SYBR Green,避免了设计、标记突光探针和使用价格昂贵、复杂的试剂。在操作方面更为简便安全，对环境污染很小。Power SYBR Green PCR Master Mix中的热启动酶常温无活性，热启动95°C IOmin后才有PCR活性，可阻断配液时的随机扩增，大大提高了荧光定量PCR反应的特异性。目前，在国内外已有应用于贝纳柯克斯体的诊断、疗效评价、药敏试验以及乳制品的质量监测。Klee等人应用此法与IFA法、capture ELISA、普通PCR法、巢式PCR相比较说明荧光定量PCR的结果更加客观可靠，重复性好，灵敏度高，特异性好，操作简单，污染少，耗时短。张晶波等人根据贝氏柯克斯体特异的23S rRNA插入基因序列(interveningsequence, IVS)设计引物和探针，以克隆的23S rRNA插入基因片段作DNA模板，在荧光定量检测仪上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系；与套式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体，检出结果均为O。亚红祥等人根据贝纳柯克斯体ISlllla基因设计引物和探针，以克隆的ISlllla基因片断(485bp)作标准DNA模板，建立实时荧光定量PCR检测方法，并与普通巢式PCR方法进行比较。结果实时荧光定量PCR的灵敏度为巢式PCR的10倍。但是由于PCR是一种敏感的定性检测方法，如检测样本或试剂受到微量目的DNA污染后很容易产生假阳性结果，严重影响检测结果的可靠性。因此，急需建立快速、敏感、稳定可靠的Q热贝纳柯克斯体特异性检测方法。由于荧光定量PCR技术具有特异性强、操作简便等优点，近年来在研究领域被广泛采用，本研究拟运用实时荧光定量PCR技术建立检测贝纳柯克斯体的SYBR Green I染料法为Q热贝纳柯克斯体检测试剂盒的研发奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供Q热贝纳柯克斯体的实时荧光定量PCR检测方法。
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为了实现本发明目的，本发明提供一种Q热贝纳柯克斯体SYBR Green I荧光定量PCR检测用引物，其中，上游引物为:5，-TGCTTCAGTATGTATCCAC-3 ’；下游引物为:5’ -GTTACGATCATTCTTGTTAC-3’。本发明还提供含有上述弓I物的检测试剂盒。本发明进一步提供利用上述引物检测Q热贝纳柯克斯体的方法，包括以下步骤:I)目的基因的扩增以Q热贝纳柯克斯体基因组DNA为模板，进行PCR反应，回收PCR扩增产物；2)目的基因的克隆将步骤I)的目的基因连接在PGEM-T easy载体上并转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，进行PCR检测并测序，提取阳性重组质粒，计算重组质粒的拷贝数；3) SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测以阳性重组质粒DNA为模板，利用上述引物进行SYBR Green I荧光定量PCR检测。在PCR的扩增产物中，除了目的基因的特异性产物外，经常会检测到一条小于特异性产物的PDs条带。要消除PDs对SYBR Green I实时定量PCR的影响，必须使仪器检测荧光信号的温度高于PDs的Tm，但低于特异性扩增产物的Tm，这样可以保证PDs处于完全解链状态，而特异性产物仍处于双链状态。根据这一问题，设置实验程序时加入了一步80°C，5s有效的去除了非特异性产物，S卩引物二聚体。上述方法，所述SYBR Green I荧光PCR扩增条件为95°C预变性5min ;然后采用二步法进行反应:95°C 10s, 58.7°C 30s, 80°C 5s，采集荧光，45个循环。上述方法，引物用量优选为0.6 μ L，引物的终浓度为1.04μΜ。上述方法，步骤(I)目的基因的扩增所用引物为:上游引物:5’ -CAATGAAATGGACCCACC-3 ’，下游引物:5’ -ATCGCGTATCTTTAACAGC-3 ’。本发明至少具有下列优点及有益效果:(1)本发明应用blast对测序后的序列进行了同源性分析，其扩增序列与原序列有99%的同源性，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，其扩增的片段大小与预期大小一致，说明所扩增的片段为目的片段，可以用于对Q热贝纳柯克斯体的检测，用含有目的片段的质粒做标准质粒，并且通过计算得出其拷贝数，进行准确定量，提高了建立Q热贝纳柯克斯体检测方法的准确性。(2)本实验建立了 SYBR Green I荧光定量PCR法，制作出了标准曲线。曲线的相关系数为0.991，大于0.98，说明曲线线性关系很好。经计算扩增效率在0.8到1.2之间，说明扩增效率很高，可用于定量未知样品，通过Ct值得出样品初始拷贝数。(3)本发明根据130bp对Q热贝纳柯克斯体的高度特异性，建立了可以简便快速、准确检测Q热贝纳柯克斯体的荧光定量PCR检测方法，有利于区分Q热贝纳柯克斯体和其他病原体，对人和动物Q热诊断具有有重要意义。(4)本发明的SYBR Green I染料法能检出IO2个拷贝数的阳性质粒，SYBR GreenI染料法与传统PCR相比，灵敏度提高了 100倍。(5)本发明利用SYBR Green I荧光定量PCR法，在扩增体系中直接加入PowerSYBR Green，避免了设计、标记荧光探针和使用价格昂贵、复杂的试剂。在操作方面更为简便安全，对环境污染很小。
图1为本发明Q热贝纳柯克斯体基因组DNAPCR扩增电泳结果，I为目的产物，2为阴性对照；图2为本发明PCR产物克隆测序序列与GenBank中ISllll基因Blast比对结果；图3为本发明不同退火温度与荧光信号强度关系曲线；图4为本发明引物不同使用量与荧光信号强度关系曲线；图5为本发明不同引物浓度熔解曲线；图6为本发明ISllll标准质粒的扩增曲线(左)与标准曲线(右)；图7为本发明标准样品熔解曲线分析；图8为本发明ISllll序列特异性实验结果曲线；图9为本发明特异性试验熔解曲线；
图10为本发明血液样品DNA的检测结果图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 Q热贝纳柯克斯体标准质粒的构建I实验材料1.1菌液、核酸、载体及宿主Q 热标准株菌已在 Chen C 等，2009 Clin.Microbiol, infect.15:2:156-157 中公开，其菌株由本实验室保存。PGEM-T Easy载体由Promega公司生产，DH5a购自北京天根生物技术有限公司。1.2试剂及试剂盒
Pfu DNA polymerase美国 Promega 公司
Pfu DNA polymerase buffer美国 Promega 公司
T4 DNA Iigase美国 Promega 公司
Plasmid mini kit I美国 Omega 公司Gel extraction kit美国 Omega 公司
DL 2000 maker宝生物工程(大连)有限公司 6Xloading Buffer宝生物工程(大连)有限公司 dNTP(各IOmM)美莱博医学科技有限公司 dNTP(各2.5mM)宝生物工程(大连)有限公司 X-Gal美国AMRESCO公司
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)美国AMRESCO公司 氣节青霉素(Ampicillin)sigma
SYBR GREEN I北京普博欣生物科技有限公司1.3主要试剂的配制(I) LB液体培养基:胰化蛋白胨(Tryptone)IOg酵母提取物(YeastExtract) 5gNaClIOg以上试剂溶于900mL去离子水，用5mol/L氢氧化钠调ρΗ7.0,定容到IOOOmL,121 °C高温湿热灭菌20min，4°C保存。(2)氨苄青霉素Amp贮存液(100mg/mL):lg氨苄青霉素溶解于IOmL双蒸水中，
0.22 um微孔滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存。
(3) Amp抗性液体培养基:在灭菌的LB液体培养基中加入Amp贮存液至终浓度为50 μ g/mL, 4°C保存。⑷Amp抗性固体培养基:琼脂粉1.5g溶于IOOmLLB液体培养基中，121°C灭菌20min,冷却至50°C左右,加入Amp至终浓度为50 μ g/mL,烧制平板,无菌检验后4°C|C存备用。(5)IPTG(20%，m/V，0.8mol/L):在8mL蒸馏水中溶解2g IPTG，用蒸馏水定容至IOml, 0.22 μ m滤器过滤除菌，分装成Iml小份于_20°C冰箱保存备用。(6) X-Gal (20mg/mL):称取 Ig X-Gal 置于 50mL 容量瓶中，加入 40mL DMF ( 二甲基甲酰胺)，充分混匀溶解后定容至50mL，用0.22 μ m过滤器过滤除菌，分装成ImL每小份，并用铝箔纸包裹，然后置于-20°C冰箱保存备用。(7)电泳缓冲液(50 X TAE贮存液):称取Tris 242g，冰乙酸57.1mL,加入IOOmL
0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)，定容至1L，用前以蒸馏水稀释为IX工作液。(8) SYBR Green I染料(电泳级)工作液:取TAE电泳工作缓冲液与SYBR GreenI染料以1: 3的比例配置。1.4 仪器
2720型PCR仪美国ABI公司
微型紫外分光光度计(ND-1000 )美国NanoDrop公司
超级恒温循环器(YT-5B)`北京亚泰科技开发中心 电热恒温培养箱(DHG-9082) 上海一恒科学仪器有限公司 电热恒温鼓风干燥箱…L^ 上海一恒科学仪器有限公司
(DHG-9070A)
恒温振荡器(THZ-C )太仓市实验设备厂 电子天平(AL-104)瑞士 METTLER TOLEDO 公司 sigma离心机(2-16P )美国sigma公司 直流电泳仪(DYY-7C)北京六一仪器厂 金属恒温仪(CHB-100 )杭州博日科技有限公司 紫外凝胶成像系统(DYY-1000B)上海天能科技有限公司 高压蒸气灭菌器MLS-3750三洋电机国际贸易有限公司 祸旋仪Vortex其林贝尔 -80°C冰箱(700Series)美国Thermo公司
超纯水仪mill1-Q美国Milipore2 方法
2.1引物的设计与合成根据Genbank发表的Q热贝纳柯克斯体编码转位酶的ISllll基因序列(索取号M80806)，应用Primer premer5.0软件设计PCR的引物，使用BLAST检索，确认各引物的特异性。引物退火温度为51.4°C。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。Q热贝纳柯克斯体的普通PCR引物如下:F:5，-CAATGAAATGGACCCACC-3’R:5，ATCGCGTATCTTTAACAGC-3，扩增片段大小:463bp2.2标准质粒的构建2.2.1目的基因的扩增以Q热贝纳柯克斯体基因组DNA为模板，用普通PCR引物，扩增出ISllll序列的目的片段。在0.2mLPCR管中加入以下试剂，反应体系(25 μ L)如下:
试剂加样量(KL )
Q热贝纳柯克斯体基因组DNA0.5
Pfu DNA polymerase buffer2.5
dNTP(各 2.5mM)2
上游引物(F) ( ΙΟμΜ)0.5
下游引物(R) (ΙΟμΜ)0.5
Pfu DNA polymerase0.5
灭菌去离子水18.5将上述液体混匀后放入PCR扩增仪中按以下程序进行扩增:
权利要求
1.一种Q热贝纳柯克斯体SYBR Green I荧光定量PCR检测用引物，其中，上游引物为:5’ -TGCTTCAGTATGTATCCAC-3’ ；下游引物为:5’ -GTTACGATCATTCTTGTTAC-3’。
2.一种含权利要求1所述引物的检测试剂盒。
3.一种利用权利要求1所述的引物检测Q热贝纳柯克斯体方法，其包括以下步骤: 1)目的基因的扩增 以Q热贝纳柯克斯体基因组DNA为模板，进行PCR反应，回收PCR扩增产物； 2)目的基因的克隆 将步骤I)的目的基因连接在PGEM-T easy载体上并转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，进行PCR检测并测序，提取阳性重组质粒，计算重组质粒的拷贝数； 3)SYBR Green I荧光定量PCR检测 以阳性重组质粒DNA为模板，利用权利要求1所述引物进行SYBR Green I荧光定量PCR检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述SYBRGreen I荧光PCR扩增条件为95°C预变性5min ;然后采用二步法进行反应:95°C IOs, 58.7V 30s, 80°C 5s，采集荧光，45个循环。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，引物用量优选为0.6 μ L，引物的终浓度为1.04 μ Μ。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(I)目的基因的扩增所用引物为: 上游引物:5 ’ -CAATGAAATGGACCCACC-3，， 下游引物:5’ -ATCGCGTATCTTTAACAGC-3’。
全文摘要
本发明提供了一种Q热贝纳柯克斯体SYBR Green I荧光定量PCR检测用引物及方法，上游引物为5’-TGCTTCAGTATGTATCCAC-3’；下游引物为5’-GTTACGATCATTCTTGTTAC-3’。本发明建立了可以简便快速、准确检测Q热贝纳柯克斯体的荧光定量PCR检测方法，有利于区分Q热贝纳柯克斯体和其他病原体，对人和动物Q热诊断具有重要意义。
文档编号C12R1/01GK103103250SQ20111035948
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者贾广乐, 林祥梅, 韩雪清, 王晓楠, 梅琳 申请人:中国检验检疫科学研究院