专利名称：生产水牛诱导多能干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及干细胞领域，尤其是一种生产水牛诱导多能干细胞的方法。
背景技术：
1981年，Evans等建立了来源于小鼠囊胚内细胞团(ICM)的ES(胚胎干细胞)细胞系。20世纪90年代，Thomson等也获得了人类和灵长类的ES细胞系。胚胎干细胞具有两大特殊属性，一是保持无限增殖和自我更新的能力；二是具有分化形成各种组织细胞的潜力，即分化成包括三个胚层在内的各种组织和细胞。鉴于人类胚胎干细胞的特殊属性，在再生医学等方面具有广阔的应用前景，如通过干细胞移植、定向分化和组织再生，可以促进创伤修复和疾病治疗。由于人类胚胎干细胞的获得存在着对早期胚胎的损害等伦理问题， 故许多研究者通过对大家畜ES细胞的研究，把有蹄类家畜ES细胞作为人类疾病模型，因为这些有蹄类家畜(如猪和牛)的体型、器官大小、解剖学特性等生理特征与人类相似。此外， 家畜ES研究也具有其本身的价值，家畜的ES细胞可以作为精确基因操作的靶细胞，进而实现家畜的定向遗传改良，造福于人类。近20年来，有蹄类家畜ES的报道很多，包括羊、马、 牛、猪、水牛等。然而，综合此类报道，这些家畜的ES细胞都命名为“ES-样”细胞，没有得到真正的家畜ES细胞系，家畜ES细胞建系仍然困难。鉴于人类ES细胞获得所面临的伦理问题和家畜ES细胞建系困难等问题，需要建立一种获得人类和家畜类胚胎干细胞的新途径。2006年，Yamanaka等采用逆转录病毒载体携带四个转录因子0Ct4、SOX2、Klf4、C-MyC将小鼠体细胞直接重编程为多能干细胞。随后， 许多研究都表明转录因子0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、E-cadherin等可以将不同物种的不同细胞重编程为具有胚胎干细胞特性的多能干细胞。由此，人类诱导多能干细胞解决了胚胎损伤的伦理问题，家畜诱导多能干细胞则解决了建系困难等问题。目前一些家畜的诱导多能干细胞，如猪、羊等，可以传至30-50代。特别是猪诱导多能干细胞，嵌合体实验表明，猪诱导多能干细胞可以产生嵌合体后代且具有生殖遗传能力，这将为家畜诱导多能干细胞进行转基因操作，改良其生产和繁殖性能提供新的途径。水牛主要分布我国南部地区，主要应用于役力、肉食和产奶。水牛奶营养尤为丰富，其蛋白、维生素及微量元素等均高于普通的牛奶。据统计，1公斤水牛奶所含营养价值相当于1. 85公斤黑白花牛奶。但是，水牛低繁殖率和低产奶量制约着水牛奶业的发展，亟待通过基因技术对水牛品种进行改良。以胚胎干细胞为靶细胞的定点精确转基因技术，是水牛定向遗传改良的一种理想方法。Huang和George等人分别使用水牛囊胚分离培养出水牛 "ES-样”细胞，并用此细胞作为转基因靶细胞和核移植供体，分别得到了表达GFP的囊胚和克隆后代。然而，由于来源于胚胎内细胞团的水牛ES细胞受材料限制、克隆形成率低、建系困难等因素制约，至今也未获得真正的水牛胚胎干细胞系。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生产水牛诱导多能干细胞的方法。
为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案生产水牛诱导多能干细胞的方法，其特征在于主要包括以下步骤< 1 >特异性转录因子的克隆分别提取水牛生殖嵴和^3-T细胞的总RNA，采用 RT-PCR技术，克隆出水牛干细胞的特异性转录因子0ct4，Sox2, Klf4，c-Myc, Nanog, Lin28 和细胞永生化基因SV401arge T (LT)，分别连接到PMD-18T载体上，经测序验证和多重序列比较后，确认目的片段正确；<2>逆转录病毒表达载体的构建以pMX逆转录病毒载体为基本骨架，目的片段经酶切后，连接到PMX载体上，构建出生产水牛诱导干细胞的逆转录病毒载体 pMX-0ct4-IRES-GFP, pMX_Sox2，pMX-Klf4, pMX-c-Myc，pMX-Nanog，pMX_Lin28，pMX-LT ；其中，为了检测诱导过程中，外源转基因的表达和沉默，将IRES-GFP连接到pMX-0ct4下游，在同一个启动子的作用下，同时表达0ct4和绿色荧光标记基因GFP ；<3>病毒的包转将携带特异性转录因子的载体分别与包膜质粒pCMV-VSVG用脂质体法共转染包装Platinum-GP细胞；转染48小时和72小时收集病毒上清液2次；新鲜的病毒上清或者经过超速离心后，采用批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度；其中，新鲜病毒的滴度为4X 106IU/mL，经超离后可达IX 108IU/mL以上；<4>水牛诱导多能干细胞的制备诱导的水牛体细胞为组织块法分离和培养的水牛胎儿耳部成纤维细胞，将携带转录因子的病毒上清等比例混合，以不同的组合(OS，0SK, OSKM，OSKMT,OSKMNL,0SKMNLT)感染水牛胎儿成纤维细胞，确定能诱导出水牛干细胞的最佳组合；其中，未经超离的病毒上清连续感染靶细胞2次，每次感染12h ；超离后的病毒上清采用1次感染20h ；经病毒感染后的细胞，胰酶消化，以5X104的密度接种到预先经过丝裂霉素处理好的小鼠胎儿成纤维细胞(MEFs)上，并改换含有白血病抑制因子(LIF)和成纤维样生长因子(bFGF)的干细胞培养基，每2-3天换液一次；在感染后12-18天，水牛诱导干细胞的初始克隆开始形成；到18-M天克隆形态明显，并表现出类似于小鼠胚胎干细胞(mES)样的形态；挑取克隆，并用Iml的注射器针头将克隆分成小块，或者用胰酶消化成小块之后接种到MEFs上继续扩增；水牛诱导干细胞分离和传代的方法类似于人胚胎干细胞(hEQ的培养方法。特异性转录因子0ct4序列为序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列；特异性转录因子Sox2序列为序列表SEQ. ID. No. 2的碱基序列；特异性转录因子Klf4序列为序列表SEQ. ID. No. 3的碱基序列；特异性转录因子c-Myc序列为序列表SEQ. ID. No. 4的碱基序列；特异性转录因子Nanog序列为序列表SEQ. ID. No. 5的碱基序列；特异性转录因子LiM8序列为序列表SEQ. ID. No. 6的碱基序列；细胞永生化基因SV401arge T序列为序列表SEQ. ID. No. 7的碱基序列。本发明采用逆转录病毒载体携带特异性转录因子0ct4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog， LiM8和细胞永生化基因SV40 large T (LT)，将水牛体细胞，如胎儿成纤维细胞，直接重编程为具有类似于胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞。水牛诱导多能干细胞的产生，可以提供一种获得水牛干细胞的新途径，可以在一定程度上弥补水牛胚胎干细胞难分离、难培养、 难建系的问题，水牛诱导多能干细胞的产生，更是为水牛干细胞信号通路及建系的研究提供干细胞来源，同时也为水牛定向遗传改良提供一条新的途径。
图 1 是 RT-PCR 克隆水牛特异性转录因子 0ct4，Sox2, c_Myc，Klf4, Nanog, Lin28 电泳图。图2是逆转录病毒载体携带水牛特异性转录因子载体构建图，图中所示载体为 pMX-0ct4-IRES-GFP和pMX_Sox2，其他转录因子的表达载体和Sox2类似。图3是水牛诱导多能干细胞形成过程不同时期细胞的形态图。图4是免疫荧光技术检测水牛诱导多能干细胞表达AP，0ct4, Sox2, Nanog, E-Cadherin, SSEA-I, SSEA-4，TRA-1-81 结果图。图5是RT-PCR检测水牛诱导多能干细胞表达干细胞相关基因0ct4，Sox2，Nanog， STAT3, GP130, F0XD3, E-Cadherin, bFGF 和 p53 结果图。图6是RT-PCR检测水牛诱导多能干细胞中外源转基因沉默和表达结果图，图中 外源转基因在biPSl和biPS2中完全沉默，在biPS3中部分表达。图7是水牛诱导多能干细胞体外分化形成拟胚体(EB)细胞图及表达三个胚层标志基因电泳图，图中AFP，GATA4(内胚层)、ACTA2 (中胚层)、TUBB3 (外胚层)。图8是水牛诱导多能干细胞体内分化形成畸胎瘤图，图中石蜡切片HE染色表明水牛诱导多能干细胞能分化为三个胚层的组织。
具体实施例方式—、水牛特异性转录因子的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建根据文献报道统计出0ct4，Sox2, c_Myc，Klf4，Nanog, Lin28在胎儿生殖嵴的原生殖干细胞中表达。Trizol法提取生殖嵴的总RNA，01igodT引物和AMV逆转录酶5min, 42° lh，95° 5min)反转得到的cDNA-20°保存备用。采用特异性引物扩取水牛诱导干细胞相关转录因子的开放性阅读框(ORF)，所选用的引物，酶切位点，退火温度如表1所示，各基因片段长度如图1所示。将PCR产物，胶回收，连接到pMDlS-T载体上，最后测序验证这些片段正确。本发明使用的逆转录病毒载体以pMX为骨架。根据载体上多克隆位点的酶切位点，双酶切PMX载体和位于pMDIS-T上的目的片段，胶回收后，连接重组质粒。最后用于诱导水牛多能干细胞的重组质粒为pMX-0ct4-IRES-GFP，pMX_Sox2，pMX_Klf4，pMX-c-Myc， pMX-Nanog, pMX_Lin28，pMX-LT，如图 2 所示。表IRT-PCR扩取水牛特异性转录因子的引物和反应条件
权利要求
1.一种生产水牛诱导多能干细胞的方法，其特征在于主要包括以下步骤<1>特异性转录因子的克隆分别提取水牛生殖嵴和^3-T细胞的总RNA，采用RT-PCR 技术，克隆出水牛干细胞的特异性转录因子0ct4，Sox2, Klf4，c-Myc，Nanog, Lin28和细胞永生化基因SV401arge Τ,分别连接到PMD-18T载体上，经测序验证和多重序列比较后，确认目的片段正确；<2>逆转录病毒表达载体的构建以ρΜΧ逆转录病毒载体为基本骨架，目的片段经酶切后，连接到PMX载体上，构建出生产水牛诱导干细胞的逆转录病毒载体 pMX-0ct4-IRES-GFP, pMX_Sox2，pMX-Klf4, pMX-c-Myc，pMX-Nanog, pMX_Lin28，pMX-LT ；其中，为了检测诱导过程中，外源转基因的表达和沉默，将IRES-GFP连接到pMX-0ct4下游，在同一个启动子的作用下，同时表达0ct4和绿色荧光标记基因GFP ；<3>病毒的包转将携带特异性转录因子的载体分别与包膜质粒pCMV-VSVG用脂质体法共转染包装platinum-GP细胞；转染48小时和72小时收集病毒上清液2次；新鲜的病毒上清或者经过超速离心后，采用批量快速测定法测定病毒滴度；其中，新鲜病毒的滴度为 4\106叨/!^，经超离后可达1\108贝/11^以上；<4>水牛诱导多能干细胞的制备诱导的水牛体细胞为组织块法分离和培养的水牛胎儿耳部成纤维细胞，将携带转录因子的病毒上清等比例混合，以不同的组合OS，OSK, 0SKM, OSKMT, OSKMNL, 0SKMNLT感染水牛胎儿成纤维细胞，确定能诱导出水牛干细胞的最佳组合； 其中，未经超离的病毒上清连续感染靶细胞2次，每次感染12h ；超离后的病毒上清采用1 次感染20h ；经病毒感染后的细胞，胰酶消化，以5X IO4的密度接种到预先经过丝裂霉素处理好的小鼠胎儿成纤维细胞上，并改换含有白血病抑制因子和成纤维样生长因子的干细胞培养基，每2-3天换液一次；在感染后12-18天，水牛诱导干细胞的初始克隆开始形成；到 18-M天克隆形态明显，并表现出类似于小鼠胚胎干细胞样的形态；挑取克隆，并用Iml的注射器针头将克隆分成小块，或者用胰酶消化成小块之后接种到MEFs上继续扩增。
2.根据权利要求1所述的生产水牛诱导多能干细胞的方法，其特征在于 所述的特异性转录因子0ct4序列为序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列； 所述的特异性转录因子Sox2序列为序列表SEQ. ID. No. 2的碱基序列； 所述的特异性转录因子Klf4序列为序列表SEQ. ID. No. 3的碱基序列； 所述的特异性转录因子c-Myc序列为序列表SEQ. ID. No. 4的碱基序列； 所述的特异性转录因子Nanog序列为序列表SEQ. ID. No. 5的碱基序列； 所述的特异性转录因子LiM8序列为序列表SEQ. ID. No. 6的碱基序列；所述的细胞永生化基因SV401arge T序列为序列表SEQ. ID. No. 7的碱基序列。
全文摘要
本发明公开了一种生产水牛诱导多能干细胞的方法，采用逆转录病毒载体携带特异性转录因子Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog，Lin28和细胞永生化基因SV40large T(LT)，将水牛体细胞，如胎儿成纤维细胞，直接重编程为具有类似于胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞。水牛诱导多能干细胞的产生，可以提供一种获得水牛干细胞的新途径，可以在一定程度上弥补水牛胚胎干细胞难分离、难培养、难建系的问题，水牛诱导多能干细胞的产生，更是为水牛干细胞信号通路及建系的研究提供干细胞来源，同时也为水牛定向遗传改良提供一条新的途径。
文档编号C12N15/12GK102433308SQ20111035969
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者刘庆友, 石德顺, 罗婵, 邓彦飞 申请人:广西大学