专利名称：大豆转录活性蛋白GmPHD5及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆转录活性蛋白GmPHD5及其编码基因与应用。
背景技术：
环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如:EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)类具有转录活性的蛋白广泛存在于动植物以及细菌、病毒蛋白中，比如哺乳动物的CBP类蛋白、人的INGl家族、酵母Yng2p蛋白、病毒MIRl蛋白。PHD类蛋白结构域是C4HC3类的锌指结构，其功能主要为以下几类:(I)作为乙酰化或去乙酰化酶参与染色质相关的转录调控；(2)作为E3泛素连接酶参与蛋白降解；(3)作为PIPs受体感知PIPs信号参与染色质相关的转录调控。在拟南芥中首次发现了 PHD类蛋白，植物中该类蛋白的功能研究尚少。
大豆是我国五大作物之一，弄清其耐非生物胁迫分子机理，进而为提高其耐逆性提供基础，具有重要的理论及现实意义。发明内容
本发明的目的是提供一种大豆转录活性蛋白GmPHD5及其编码基因与应用。
本发明所提供蛋白，名称为GmPHD5,来源于大豆属大豆(Glycine max(L.)),是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列2由252个氨基酸残基组成。
上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述蛋白GmPHD5的编码基因GmPHD5也属于本发明的保护范围。
该基因可为如下⑴或⑵或⑶的DNA分子:
(I)序列表中序列I所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子;
(3)与⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90% 、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1 % SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS、0.5MNaPOJP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC，0.1 % SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5X SSC, 0.1% SDS 中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，0.1 X SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65°C，0.1 XSSC,0.1% SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, 0.1% SDS 和 I X SSC, 0.1% SDS 各洗膜一次。
其中，序列表中的序列I由759个脱氧核苷酸组成，本序列为GmPHD5基因的读码框，编码具有序列表中序列2的氣基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
上述重组载体具体为将蛋白GmPHD5的编码基因插入pBIN438载体的BamHI和KpnI识别位点间得到的重组载体；
本发明还保护了扩增上述蛋白GmPHD5的编码基因全长或其任意片段的引物对。
上述引物对可为扩增GmPHD5的所有引物对，具体可为如下⑴或(II):
(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；
(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。
上述蛋白、基因、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物中的应用是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法，是将上述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
在该方法中，所述蛋白的编码基因通过所述重组载体导入所述目的植物中；
在该方法中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；
在该方法中，所述耐旱性体现在增加根长、提高发芽率和/或提高存活率；
在该方法中，所述耐盐性体现在提高存活率；
在该方法中，所述目的植`物为双子叶或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或豆科植物。在本发明的一个实施例中为拟南芥。
所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的耐逆性性状得到改良。
所述基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果:
I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35 %,优选为多于45 %,更优选为多于50%，最优选多于约60% ；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。
携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本发明的实验证明，GmPHD5的表达在耐逆性大豆品种晋豆23中受高盐、干旱和低温诱导，也受植物激素脱落酸ABA的诱导。已知ABA与植物非生物胁迫应答相关，因此GmPHD5可能与植物对非生物逆境应答的调控相关。之后将GmPHD5基因经农杆菌介导，导入模式植物拟南芥中，获得了过量表达GmPHD5基因的植株，转基因植株与对照相比，其耐盐和耐旱性均有显著提高，GmPHD5基因能够显著提高植物的耐盐、耐旱性。说明GmPHD5参与植物对非生物胁迫应答的调控。
本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义。并且从分子生物学角度证明了 PDH家族中的一些成员确实参与植物对非生物胁 迫应答的调控，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1为GmPHD5基因在高盐、低温、干旱及ABA (脱落酸)处理时的转录特征
图2为植物表达载体pBIN438-GmPHD5的示意图
图3为GmPHD5过表达转基因植株的分子鉴定
图4为GmPHD5过表达植株的耐盐性鉴定
图5为GmPHD5过表达植株和对照在盐胁迫下的发芽率比较
图6为GmPHD5过表达植株与对照的耐盐性鉴定
图7为GmPHD5过表达植株与对照在盐胁迫下的根长比较
图8为GmPHD5过表达植株和对照在干旱胁迫下的存活率比较具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值土标准差。
大豆晋豆23(JD23)及旱敏盐敏品种灰布支(HBZ)记载在Wei W，Huang J,Hao YJ,Zou HF，Wang HW,Zhao JY,Liu XY，Zhang WK,Ma B,Zhang JS and Chen SY (2009)SoybeanGmPHD-Type Transcription Regulators Improve Stress Tolerance in TransgenicArabidopsis Plants.PLoS ONE，4 (9)，e7209.公众获得山西农科院经济作物所同意后可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；
pBIN438载体(双元表达载体)由方荣祥院士惠赐。记载于李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(B辑)，1994，24 (3):276-282.，公众经方荣祥院士同意后可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1、大豆GmPHD5及其编码基因的`筛选及其cDNA的克隆
1、大豆GmPHD5及其编码基因的获得
以大豆抗旱品种晋豆23(JD23)和旱敏感品种灰布织(HBZ，由山西农科院经作所刘学义研究员提供)为材料，通过cDNA-AFLP的方法筛选得到60余个差异表达基因，其中有一个296bp片段，该片段经BLAST大豆EST数据库表明其为包含PHD结构域的锌指蛋白，在比对中发现在多个物种的旱、盐cDNA库中有该基因的同源序列。经在大豆EST数据库中比对得到6个该家族成员，分别命名为GmPHDl-6。其中基因GmPHD5具有序列表中序列I的核苷酸序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由252个氨基酸残基组成。
根据GmPHD5基因序列设计引物:
GmPHD5 sense:5 ‘-ATGGAAGGAGTACCGCACCCAATA-3 ’(序列 3)，
GmPHD5 antisense:5 ‘-TCAAACTCTAACCCTCTTGTTACT-3’(序列 4)
应用RT-PCR方法，从大豆总RNA中扩增GmPHD5基因。取晋豆23 (JD23)叶片，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5 μ g总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20 μ I PCR反应体系为:1μ I 一链。0嫩(0.05 48)、1“1 引物(20μΜ)、2μ I IOXPCR 缓冲液、0.4 μ IdNTP(IOmM)和IU Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20 μ 1，液面覆盖液体石蜡油。反应在ΡΕ9600 型 PCR 仪上进行，其程序为 94°C变性 5min ;再 94°C lmin, 56°C lmin, 72°C lmin,共30-32个循环；然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。得到约750bp的PCR产物，该PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中序列I的核苷酸序列，即得到基因GmPHD5，编码蛋白命名为GmPHD5，其氨基酸序列为序列表中的序列2。
将PCR产物克隆于pMD18_T质粒的多克隆位点，得到重组载体pMDGmPHD5，经测序，该载体为将序列表中的序列I插入PMD18-T质粒的多克隆位点得到的载体。
2、GmPHD5基因在非生物胁迫下的表达特征
对大豆耐旱耐盐品种晋豆23(JD23)及旱敏盐敏品种灰布支(HBZ)进行干旱、NaCl、ΑΒΑ、冷害处理，用于分析大豆GmPHD5在非生物胁迫和脱落酸(ABA)处理下的转录特征。将晋豆23和灰布支的种子种在盆中，生长2星期后，对幼苗分别进行下述胁迫处理:
干旱处理:将大豆幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，分别在光照条件下干旱培养O小时、I小时、3小时、6小时和12小时后取样。
盐处理:将大丑幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中，分别在光照培养O小时、I小时、3小时、6小时和12小时后取样。
ABA处理:大豆幼苗的根系置于100 μ M ABA中，分别在光照培养O小时、I小时、3小时、6小时和12小时后取样。
低温处理:将小麦幼苗置于0°C培养箱中，分别在光照培养O小时、I小时、3小时、6小时和12小时后取样。
总RNA的提取同上述I。应用Real Time PCR分析GmPHD5基因在上述处理时的转录特征，所用引物同上述I。以大豆beta-tubulin为内参，内参的引物为:
GmTubRL-1: TGGCCGCTACCTCACTGCCT
GmTubRL-2: TCGTCCATGCCTTCCCCGGT
结果如图1所示，在高盐胁迫下，两种大豆中的GmPHD5基因均受到胁迫的诱导，前期灰布支中转录较高，而12小时时，晋豆23中的转录明显升高。干旱胁迫下，灰布支中GmPHD5转录在胁迫3小时时上升，至6小时回落，12小时再上升，而在晋豆23中，胁迫I至3小时，下降至6小时时明显升高，12小时升至最高。在两种大豆中GmPHD5转录均不受低温诱导。ABA处理下的转录，在灰布支中不受诱导，而在晋豆23中GmPHD5受到强烈诱导。上升结果表明GmPHD5可能参与植物对非生物胁迫的应答反应。
实施例2、GmPHD5蛋白的功能鉴定
一、转GmPHD5基因拟南芥的获得
1、重组表达载体pBIN438-GmPHD5的构建
提取大豆抗旱品种晋豆23 (JD23)的RNA，反转录得到cDNA，以G5BamH I和G5KpnI作为引物进行PCR扩增 ，得到756bpPCR产物，用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切得到的PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pBIN438得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中的序列I自5’末端第1-759位核苷酸插入pBIN438的BamHI和Kpn I酶切位点之间得到的载体，将该载体命名为pBIN438-GmPHD5，且序列表中的序列I自5’末端第1-756位核苷酸位于CaMV 35S启动子之后。重组表达载体pBIN438-GmPHD5部分结构示意图如图2所示。
G5 BamH 1:GAAGGATCCATGGAAGGAGTACCGCACCC (序列 5)
G5 Kpn 1:GAAGGTACCAACTCTAACCCTCTTGTTAC (序列 6)
2、转GmPHD5基因植株的获得和鉴定
I)重组农杆菌的获得
将上述I得到的重组表达载体pBIN438-GmPHD5，通过电击法导入转化农杆菌 GV3101(Tang ff, Sederoff R, Whetten R., Regeneration of transgenic loblollypine (Pinus taeda L.) from zygotic embryos transformed with Agrobacteriumtumefaciens, 20010ct ；213 (6):981-9,公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)，得到重组农杆菌。
提取重组农杆菌的质粒，送去测序，结果为该质粒为pBIN438-GmPHD5，将含有该质粒的重组农杆菌命名为GV3101/pBIN438-GmPHD5。
通过用抽真空法将GV3101/pBIN438-GmPHD5转入野生型哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0, Clough-SJ, Bent-AF.Floral dip:a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16:6，735-743，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以下简称野生型拟南芥。)，具体操作为:将野生型拟南芥Col-O的花浸泡于转化液(MS0.0llg, Sucrose 0.25g, Silwet 0.5 μ I,重蒸水稀释至 5ml, ρΗ5.8)中 10 秒，取出后放入MS培养基中避光培养8小时，获得Ttl代转化种子，将其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培养基上，获得29株Ttl代转GmPHD5拟南芥。
提取Ttl代转GmPHD5拟南芥的总RNA进行RT-PCR鉴定分析，以野生型拟南芥为对照。
引物如下:
5， -ATGGAAGGAGTACCGCACCCAATA-3’
5， -TCAAACTCTAACCCTCTTGTTACT-3，。
结果表明，得到PCR产物为756bp的为阳性Ttl代转GmPHD5拟南芥，即为GmPHD5基因的表达，可以看出，在29株Ttl代转GmPHD5拟南芥中，有19株为阳性Ttl代转GmPHD5拟南芥，而野生型拟南芥均没有检测出目的基因的表达。
将分子鉴定阳性的Ttl代转GmPHD5拟南芥单株收种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T1代的分离情况，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系，共获得13个稳定遗传的T3代转GmPHD5拟南芥。
T0代表示转基因当代植株，T1代表示Ttl代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
选择稳定遗传的T3代转GmPHD5拟南芥株系中GmPHD5表达高、低有区别的4个株系，G5-9、G5-11、G5-21和G5-24再进行RT-PCR验证，方法同上，以野生型拟南芥为对照，结果如图3所示，该4株转GmPHD5基因的T3代植株中，GmPHD5基因均有不同程度的表达，而野生型拟南芥则未能检出表达。
以相同的方法将空载体PBIN438转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，提取总RNA进行RT-PCR鉴定分析，结果未得到目的片段，说明得到了转空载体拟南芥，同样播种处理，得到T3代转空载体拟南芥。
二、转GmPHD5拟南芥的功能研究
在正常条件下，从幼苗期开始观察转GmPHD5植株与转空载体对照植株之间的差另O，地上部分不论叶片形状、叶片大小、抽苔时期和抽苔高度方面，转GmPHD5植株与转空载体对照植株并没有明显差别。
1、耐盐性试验:
将野生型拟南芥(对照)、T3代转空载体拟南芥和T3代的转GmPHD5拟南芥的4个转基因株系(G5-9、G5-11、G5-21和G5-24)同时播种在含有0、50、100和150mM NaCl的1/2MS培养基上，23-240C，光照16小时/天，4天，统计发芽率。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。
结果如图4所示，可以看出，在未胁迫和50mM NaCl胁迫下，T3代的转GmPHD5拟南芥的发芽率略高于野生型拟南芥(对照)，但差别不显著，在IOOmM和150mM NaCl胁迫下，不同株系的发芽率有明显差异，具体如图5所示:
野生型拟南芥(对照，WT)和T3代的转GmPHD5拟南芥株系G5-9、G5-11、G5-21及G5-24在IOOmMNaCl胁迫下的发芽率依次为67±5 %、79±7 %、69±5 %、84±7 %和81±9%，而在150mM NaCl处理后的发芽率分别为46±5%、65±3%、60±2%、62±5%和60 ± 5 %。
除了 G5-11在IOOmM NaCl胁迫下外，所有胁迫下过表达GmPHD5植株(T3代的转GmPHD5拟南芥株系)的发芽率均显著或极显著高于对照(野生型拟南芥)。
进一步用垂直板培养基根长分析各转基因株系与对照的耐盐性，具体如下:将野生型拟南芥(对照，WT)、T3代转空载体拟南芥和T3代的转GmPHD5拟南芥(G5_9、G5-11、G5-21和G5-24)种子分别种于MS培养基和含有150mM NaCl的1/2MS培养基中，春化3天，生长5天，移植到垂直平板培养基中垂直培养，23-240C，光照16小时/天，10天，观察根生长状况。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。
结果如图6所示，在MS培养基中(未处理)，T3代的转GmPHD5拟南芥和野生型拟南芥(对照，WT)间没有明显差异，在含有150mM NaCl的1/2MS培养基中，T3代的转GmPHD5拟南芥的根长相比野生型拟南芥明显更长。
具体结果如图7所示，
在MS培养基中(未处理)，各植株根长分别为:对照为5.1cm、G5-9为4.83cm、G5-11 为 5.33cm、G5-21 为 5.74cm 和 G5-24 为 4.81cm,而在含有 150mM NaCl 的 1/2MS 培养基中，T3代的转GmPHD5拟南芥的根长相比野生型拟南芥明显更长，分别约为:对照为1.07cm、G5-9 为 2.52cm、G5-11 为 3.58cm、G5-21 为 2.51cm 和 G5-24 为 2.5cm。
野生型拟南芥与T3代转空载体拟南芥的结果无显著差异。
2、耐旱性实验
以培养基中添加甘露醇模拟干旱胁迫。将野生型拟南芥(对照，WT)、T3代转空载体拟南芥和T3代的转GmPHD5拟南芥(G5-9、G5-11、G5-21和G5-24)的种子种于1/2MS培养基，春化3天，生长5天后，将幼苗分别移植于含200mM和300mM甘露醇的培养基中继续培养，23-24°C，光照16小时/天，10天后，将幼苗移植于蛭石中，恢复浇水一周。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。以1/2MS培养基为对照。
统计存活率，结果如图8所示，在1/2MS培养基里，转基因植株和野生型对照的存活率无差别，均为100%，而在含有200mM和300mM甘露醇的培养基中有明显差异。200mM甘露醇下存活率分别为:WT为39%、G5-9为83%、G5-11为89%、G5-21为94%和G5-24为100%，在 300mM 甘露醇下存活率为 WT 为 33%、G5_9 为 50%、G5_11 为 39%、G5_21 为 56%和G5-24为50 %。结果说明除了在300mM甘露醇里G5-11仅比对照略高外，其他条件下，转基因植株的存活率都显著高于野生型对照。
野生型拟南芥与T3代转空载 体拟南芥的结果无显著差异。
上述实施例说明，GmPHD5参与植物对盐和旱胁迫的应答，其编码基因的过量表达可提高转基因植株的耐盐、耐旱性。
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下(1)-(4)中任意一种DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)序列表中序列I自5’末端第1-756位所示的DNA分子； (3)在严格条件下与(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子; (4)与(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于: 所述重组载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因插入PBIN438载体中，得到表达权利要求I所述蛋白的重组载体。
6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对， 所述引物对具体为如下(I)或(II): (I)、所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4 ； (II)、所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列6。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物中的应用。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
9.如权利要求 8所述的方法，其特征在于:权利要求1所述蛋白的编码基因通过权利要求5所述重组载体导入所述目的植物中； 所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述耐旱性体现在增加根长、提高发芽率和/或提高存活率； 所述耐盐性体现在提高存活率； 所述目的植物为双子叶或单子叶植物； 所述双子叶植物具体为拟南芥或豆科植物。
全文摘要
本发明公开了一种大豆转录活性蛋白GmPHD5及其编码基因与应用。该大豆PHD转录因子，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，该大豆PHD转录因子GmPHD5及其编码基因可用于培育耐逆植物品种，GmPHD5基因能够显著提高植物的耐盐、耐旱性。
文档编号C12N5/10GK103102402SQ201110360138
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者陈受宜, 张劲松, 韦伟, 张玉芹, 刘学义, 张万科, 马彪, 林晴 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所