专利名称：玉米真菌诱导型启动子及活性分析的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，在真菌病害胁迫下它可以作为启动子调控基因的表达。具体涉及一种来源于玉米endochitinase A基因ZmECA，并在植物中高度表达的真菌诱导型启动子序列。
背景技术：
中国是一个人口众多的农业大国，粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。植物病害一直是农作物优质高产的重要制约因素之一。在植物病害中，70% 80%的病害是由病原真菌侵染所致。植物真菌病害不仅直接造成农作物产量下降与品质降低，而且部分病原真菌在侵染过程中，可分泌产生多种对人畜有害的毒素与代谢产物，对农产品的安全构成极大威胁。目前，重大农作物真菌病害的控制往往依赖化学防治，杀菌剂的使用不仅增大生产成本，而且其反复施用不可避免地带来环境污染、抗药性及农产品农药残留等一系列问题。因此，加强植物病原真菌致病机理、寄主植物抗病机制及培育抗病品种等关键问题的研究，可为植物真菌病害控制新策略的制定与防治关键技术的研发奠定理论基础，从而进一步为我国农作物优质高产、降低生产成本、减少环境污染与农产品农药残留提供技术保障。自转基因技术成熟以来，科学家们已经得到了很多转基因品种。然而，由于转入的基因大多数是由组成型启动子驱动表达的，组成型启动子具有高效表达、且在植物整个生长期都表达的特点，这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点，不利于植物的正常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，能够快速有效地诱导基因的转录，来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特定的组织器官、环境下诱导基因转录，解决组成型启动子面对的问题。迄今为止，从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。目前，分离和鉴定的真菌诱导型启动子并不多，主要有查耳酮合成酶、苯丙氨酸裂合酶、异黄酮还原酶、谷胱甘肽-S-转移酶基因启动子片段、水稻肌动蛋白基因(Actl)启动子序列、松树的1，2-二苯乙烯合成酶、拟南芥植物防御素PDF等基因的启动子。中科院遗传所的孙勇如等从天麻中分离得到天麻抗真菌蛋白(GAFP)的启动子，以GUS为报告基因转化烟草后，证明了该启动子能够在真菌诱导下启动GUS基因在转基因烟草中表达，其活性大大高于植物表达系统中常用的CaMV35S启动子。利用真菌诱导型启动子驱动抗真菌基因的高效表达，从而改良作物的抗病性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗真菌相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种真菌诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米endochitinase A基因ZmECA。本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的真菌诱导型启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因ZmECA的真菌诱导型启动子序列和5’非翻译区。本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚，该转基因玉米胚能反映启动子诱导活性的高低。为实现上述目的，本发明克隆了玉米endochitinase A基因ZmECA的真菌诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmECA基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达，并观察到该启动子与真菌诱导相关的高水平活性。本发明提供一种获得的玉米真菌诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的-Ibp至-17^bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，真菌可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。获得的玉米真菌诱导型启动子序列源自玉米endochitinase A基因ZmECA。一种克隆得到的玉米endochitinase A基因ZmECA的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的+Ibp至+99bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的玉米endochitinase A基因ZmECA的5’非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的真菌诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米真菌诱导型启动子序列和玉米endochitinase A基因 ZmECA的5’非翻译区。上述用于玉米转化的真菌诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB(右边界序列)和 LB (左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agroba terium tumefaciens) Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如PCAMBIA1301载体、 PBI121 载体。一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚，包含玉米真菌诱导型启动子序列和玉米endochitinase A基因ZmECA的5，非翻译区。本发明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301)，所述的玉米 endochitinase A基因ZmECA的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米endochitinase A基因ZmECA的启动子和5’ 非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。本发明提供一种应用真菌诱导型瞬时表达的玉米成熟胚。植物能通过使用根癌农杆菌(An，G. 1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法 (Lacorte等，1997，Plant Cell R印orts)将上述植物真菌诱导型启动子二元载体进行转化。本发明提供来自玉米endochitinase A基因ZmECA的真菌诱导型启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区，使得能够在植物中进行真菌诱导表达。
本发明的有益效果在于可用于启动抗真菌基因的高效表达，应用于不耐真菌的植物中使植株获得抗真菌的性状，对于解决真菌病害常发地区粮食危机问题有积极意义。
图1为玉米(B73)基因组电泳 2 为 ZmECA-pro PCR 电泳3为ZmECA-pro连T载酶切鉴定电泳 4 为 ZmECA-pro 连 pCAMBIA_1301PCR 鉴定电泳5为ZmECA-pro连pCAMBIA-1301酶切鉴定电泳6为pCAMBIA 1301 ZmECA-Pro转农杆菌PCR鉴定电泳 1 至图 6 中=Maker 从大到小依次为 1849bp ； 1470bp ； 1090bp ；738bp ；424bp ； 280bp图7为植物表达载体构建示意8为ZmECA启动子的⑶S检测(背面)照片
图9为ZmECA启动子的⑶S检测(正面)照片图8和图9中ZmECA(a)水杨酸处理；ZmECA(b)未处理；35S 应用最广泛的组成型启动子
具体实施例方式下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式
来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。实施例1 玉米endochitinase A基因ZmECA的真菌诱导型启动子的克隆玉米endochitinase A基因ZmECA的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID N0: 1的转录起始位点的-Ibp至-17^bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米ZmECA基因的5’非翻译区序列中得到鉴定。玉米endochitinase A 基因 ZmECA 登录在 NCBI GenBank (登录号 NM_001165432. 1)，序列表显示本发明上述基因的植物真菌诱导型启动子和5’非翻译区的 DNA序列。在本文件的启动子序列表中，转录起始位点的碱基C用+1示出。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站 http //bioinformatics, psb. ugent. be/webtools/plantcare/ html/。以玉米基因组DNA (图1)为模板，扩增得到目的片段，经1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 扩增出长度为I^Sbp的条带(图2)，并进行回收。回收片段与PMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD18-T: ZmECAPro，提取质粒并进行酶切验证(图3)，并测序。更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米endochitinase A基因ZmECA的启动子和 99bp的5’非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增， 反应程序:95V 3min ；95°C 30S，58. 5°C 30S，72°C 2min，32 个循环；72°C IOmin ；
表1:引物
上游引物5' CCCAAGCTTTGAGAAAAGGATGAGGMCTG 3'SEQ ID NO 2下游引物5' CATGCCATGGACTGGGTTCACAGCGMCT 3'SEQ ID NO 3 实施例2 植物真菌诱导型载体的构建将在实施例1中所克隆的玉米endochitinase A基因ZmECA的真菌诱导型启动子和99bp的5’非翻译区ZmECAPro (见序列表)插入到载体中，从而构建植物真菌诱导型载体。更具体地说，是将植物表达载体pCAMBIA 1301及重组质粒pMD18_T ZmECAPro用 HindIII和NcoI分别进行酶切，然后将它们插入载体pCAMBIA1301的HindIII和NcoI酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301::ZmECAPro，用于驱动⑶S基因的表达，经PCR鉴定(图 4)和酶切鉴定(图幻获得启动子与载体的重组质粒。在图7中，以编码β -葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因，此外35s-pro代表HPTII的启动子，而35s_ter代表HPTII的终止子，ZmECAPro代表 ⑶S的启动子，而Nos-ter代表⑶S的终止子。实施例3 鉴定本发明所述的玉米真菌诱导型启动子的活性通过电激转化法，将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301: ZmECAPro转移到根癌农杆菌EHA105中，提取质粒并进行PCR鉴定(图6)。为鉴定启动子的真菌诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法将玉米的胚用水杨酸处理后再检测GUS的活性。更具体地说，是将玉米种子浸泡催芽，然后将种子纵切成两半，水杨酸诱导培养24h，将玉米种子在⑶S检测液中于37 °C过夜，⑶S检测液3mg/ml X-gluc (5-溴-4-氯-3- 口引哚-β -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH = 7. 0)，IOmM EDTA,0. 5mM铁氰化钾、0. 5mM亚铁氰化钾、0. 1% iTritonX-IOO, 20%甲醇。如图8和图9所示，经过4°C诱导的玉米胚显示出高水平的GUS活性，而未经诱导的玉米胚显示出低水平的 ⑶S活性。工业实用性如上所述，本发明提供玉米endochitinase A基因ZmECA的真菌诱导型启动子和 5’非翻译区。本发明提供分别将玉米endochitinase A基因ZmECA的启动子和5’非翻译区插入至pCAMBIA1301而获得的植物表达载体。经使用所述的植物表达载体进行鉴定，本发明所述的玉米endochitinase A基因 ZmECA的启动子和5’非翻译区能够在真菌诱导后，启动下游基因的表达。因此，本发明可用于提高抗真菌基因的启动活性，最终获得能用于生产的抗真菌粮食作物或植被。SEQ ID NO. 1的序列(带功能元件标记)⑴序列特征(A)长度-lbp至-1729bp ；+Ibp至+99bp ； (B)类型核苷酸；(C)
链性单链。
(ii)分子类型核苷酸(iii)序列描述=SEQ ID N0. 1-1729 TGAGAAAAGG ATGAGGAACT GCCACACGCG CGCGCCGCTG GCCCGACTAGTCA-eIement-1679 GCCGTGGCCG TGGTAGATCA GACTTTGGTC CGAATATTTA TTCCTAACGG-1629 TTGCGATTTT GCCTGGAGTG ATGATCGTCC GTTACTGGTC GTTTCCTGTG一 一-1579 TTATGACTAT TAACAGACGG GTTGTAATGA CTGTCAGCTA GTAACAGACGSkn-I motifSkn-I motifCGTCA-motif-1529 TCACTGATGG CGCCAGTTTC TGGCAGGCTG TAACGGTAGC TCTGATGGCG-1479 ACCGTTACTT CCCGTTGGTC TCCATCTGCG CGTGTATATA TACGGAGGAGCCAAT-box 一一 T ATA-box-1429 CTAGGTGAGA CTGCTTCTGG TGACGACATC ACGTACGAAC ACCAAACAGT一CGTCA-motif ABRE-1379 CTCAGACACG TTACACACAT CTATTCCCGT CCCCACCTTC TGCGAGCACAA-box-1329 AAGAGTGTGG GAGAGCAGGC CTTCGAAATC GCGGTCCACA GAGCGACACTCCGTCC-box-1279 TGCACGAGTG TGCGGGTGAT CAGGTTTTTA GGGAGCGTAC TCGCGACTGCTATA-box-1229 TTGCTTCGTC TGCTCGACCA GCACTAATCA GGTTGCTCAT CGCCGACGCC-1179 GTTAGAGGGA CCGCACTGCG TATATCTGCC TGCGTCGACT GCGTACGATTTATA-box-1129 ACATCGAACA TGCACACGAG ATATCTCGTG TGAATGAAGC CACTTTTGCCCAT-box —-1079 TTGAGCATCG GAGCATCCGT AGGGCACACT TTGTTCTAAG TATTTGTGCACAAT-box-1029 TATTTTACTG TTGTTTACTG TTTACGTGAG TAGTAATACA CATACATATATATA-boxABRETATA-box TATA-box-979 CATGTTGTCA CATATATCAC TGTGATTTTC TAGATTAAAT TAAAACTGAATATA-box-929 AATATCTATT TCTTGAACAA TATAAGTGCT AAAACAACTA ATATTTTGGTCAAT-box一 TATA-box-879 CTGGAGGGAG TTTTACATAA CAAGGGGGGA GTATGTCGTT GTATAGACGATATA-boxTCA_element TATA-box-829 GGCAATTTAT TGTTTTAGCT CAAGCCCCAC GAAACTAACT CCGTCTCAAGCAAT-box TATA-box-779 AAAATCTTCT AAATTCCTCG CGAGAGAACA CAATACTCTA TTATACTCCCCAAT-box TATA-box
-729 TTTTTATTTT CTTTACTTGA CGTTTTGTAG TTCATTTTTG TACTATTTAGTC-rich repeats 一一-679 CGTCAGATAT AAAAAGATGA ATATACTCTA AGAGTAGCGA AACCATGAATCGTCA-motif TCA-element TATA-boxARE-629 AGTGAATAAG GAAGAAAAAC TCTAAAGAGC TTTCTAGAGA AATACTAAAA-579 ATATATAAAA AGGGAAAATC CTAGTCTTCG TTTGATCGTG CATGCATATGTATA-box-529 TGTGGCCCAA CCGCCCAATC CATCACCGGT ACGTGCTCCA GGCTGTAGCTCAAT-box一 ABRE-479 GCTTGGAAGT CTTCCGTTCT TGCTTGACCG ATTCCTGCTA GCCTTTGGAAMBS-429 CACGGAGACC GAGGCCACCA ATAAATCCTC ACATGCGTGG TACTGGTACG—CAAT-boxABRE-379 TGGAATTGAA GCAAACAAAA TACGGCTGCC CGCGGCGGCC GGATAATATACAAT-boxTATA-box-329 TAAGATGATG GCGGCAAATT GTCTTCGCAG ACGAGAAAAA TCGCAGGAAACAAT-boxHSE-279 GCGGTGACTT CTAGCAGGTA GCATGTGCGG ATTTTCCACC GCGATGGGCG-229 GCGGCGGCGG CAATCCAAAT CTGATGATAT CTCAACCTAG GCTAGAGTGCCAAT-box一-179 TTGTGTCTCG ATACATGGTG CGTTGCATGC ATTGCTGACC CATGCGTCAA一CAAT-box CGTCA-motif-129 AAGTTCATCA TAAAACGTGG GACAGCTGTA CGTTCCCGCG TGCAATGGTGTATA-boxCAAT-box-79 GACATCACAC CTAGCCACTC CACGTCGCAT GCCATGCATC GACAGGATGCCAT-box+1-29 ACGTTCCGAT CCCTATATAA AGGGGCACCC TTGTGACACC TCAAATCACCTATA-boxCAAT-box+22 TCACACAACA AGCTGCACCG CAGCAACGAA CACGAACCTT GGCAGAACGA+72 AGCTGAAGTA GTTCGCTGTG AACCCAGT
权利要求
1.一种获得的玉米真菌诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列包含相对于 SEQID NO 1的转录起始位点的-Ibp至-17^bp区的DNA核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的获得的玉米真菌诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列源自玉米endochitinase A基因ZmECA。
3.根据权利要求2所述的获得的玉米真菌诱导型启动子序列，其特征在于一种克隆得到的玉米endochitinase A基因ZmECA的5，非翻译区包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的+Ibp至+99bp区的DNA核苷酸序列。
4.一种用于玉米转化的真菌诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米真菌诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米endochitinase A基因ZmECA的5’非翻译区。
5.一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚，其特征在于所述转基因玉米成熟胚包含权利要求1所述的玉米真菌诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米 endochitinase A 基因 ZmECA 的 5，非翻译区。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米真菌诱导型启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供一种获得的玉米真菌诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO1的转录起始位点的-1bp至-1729bp区的DNA核苷酸序列；同时提供用于玉米转化的真菌诱导型的植物表达载体，包含玉米真菌诱导型启动子序列和玉米endochitinase A基因的5’非翻译区；用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚；SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的PCR引物适于扩增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段。本发明可用于启动抗真菌基因的高效表达，应用于不耐真菌的植物中使植株获得抗真菌的性状，对于解决真菌病害常发地区粮食危机问题有积极意义。
文档编号C12N15/11GK102373209SQ20111036048
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者余刚, 刘金亮, 张世宏, 李桂华, 潘洪玉, 贾承国, 赵淑莉, 陈宣明 申请人:吉林大学