专利名称：真菌感染激活的植物启动子的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及可用于诊断和治疗植物的与真菌病原体体和宿主植物之间易感性性作用相关的真菌感染的遗传序列。特别是本发明提供了植物中、对易感性作用中植物真菌病原体对所述植物的感染应答而启动、激活或增强基因的表达的遗传序列。本发明还提供了诸如结构基因的遗传序列，当植物和真菌病原体间发生易感性作用时，该基因的表达被诱导。本发明还提供了检测易感性作用中真菌病原体感染及制备对所述真菌病原体的抗性提高的转基因植物的方法。本发明对于提高作物种类的疾病抗性特别有用。
在下面的全部本专利说明书和权利要求中，除非另有说明，“包括”，或“包含”或“含有”应理解为是指包括所指明的成分或成分的组，但不排除任何其它成分或成分的组。
本专利说明书作者所引用的出版物的详细文献目录集中在说明书的末尾。本专利说明书中所涉及的核苷酸和氨基酸序列的序列表(SEQ ID No)列在文献目录后。
植物生物技术学的发展已经显著改变了用于提高农业生产单位的经济产出的方法。农业和园艺工业最关心的是植物病原体感染造成产率下降。植物真菌病原体，特别是锈病真菌，是田地作物如豆科和谷类植物中特别重要的问题。生物技术为解决这一问题提供了广阔的前景，例如将重组基因引入植物杀灭真菌病原体，或将真菌病原体限制在有限的感染区中，从而防止重要经济作物的严重损害。因而用生物技术方法发展抗病植物是农业和园艺业研究的重要目的。
遣传分析显示植物基因组的锈病抗性基因控制锈病无毒性基因之产物的特异识别。锈病病原体和植物宿主间的作用可根据真菌感染如何进展而分为“抗性”或“易感性”。在抗性作用中，真菌病原体的感染产生“植物高敏反应”(Marineau等，1987；Dixon和Lamb，1990)，造成细胞死亡从而限制真菌的扩散。在高敏反应中，几种感染相关基因的表达被开启，例如编码植物抗毒素、抗微生物素和致病相关(PR)蛋白的基因。相反，易感性作用不涉及高敏性细胞死亡，而感染改变宿主细胞的基因表达，提供专性植物病原体生物营养生成所必需的基因产物。因而这两个过程是截然不同的，它们涉及不同的宿主细胞基因和调节所述宿主细胞基因表达的机制。这一区别具有至高的重要性。例如在易感性作用中诱导的那些宿主基因可以是锈菌在植物组织中生长所必需的。
大部分研究集中在抗性作用的高敏反应中的蛋白编码基因的鉴别和遗传操作上(Collinge和Slusarenko，1987；Dixon和Lamb，1990，Keen，1992；van Loon，1985；Ohashi和Ohshima，1992)。Marlini和Strittmatter(专利申请WO93 19188)已用prp1基因(特别是prp1-1基因)的启动子构建了真菌反应性嵌合基因，以在真菌病原体感染的植物细胞中直接表达“杀伤”基因。但prp1基因只能在抗性作用中(即致病相关真菌感染中)被诱导。虽然诸如prp1基因的遗传序列可以提供控制抗性作用中病原体的工具，但植物和真菌病原体易感性作用中的宿主细胞遗传序列的分离不是一个简单的过程。
在亚麻植物Linum usitatissimum和亚麻锈菌高粱杆锈菌的完全易感性作用中，并未迅速的宿主细胞死亡或退绿。相反，宿主细胞的代谢被引向活的真菌孢子的生成，包括例如光合作用经吸器或真菌的吸收器官易位至菌丝体。虽然在亚麻植物的易感性锈菌感染中观察到蛋白合成模式的改变(Sutton和Shaw，1996)，直到本发明之前仍不可能区分真菌蛋白合成和对植物蛋白合成的修饰。因此，在易感性锈菌感染中表达被诱导的亚麻遗传序列的分离不是一个简单的过程。
在完成本发明的工作中，本发明者致力于发展对真菌病原体抗性提高的植物，该真菌病原体原本可以在易感性作用中感染植物。因此，本发明者鉴定了亚麻和玉米中应答于易感性锈菌感染而表达提高的植物遗传序列。这些序列的克隆提供了产生具有提高的或增强的抗真菌特点的转基因植物的方法。特别是，通过将一细胞毒基因、抗真菌基因、反义核酸、核酶或共抑制分子置于衍生自通常应答于易感性感染而被转录上调的遗传序列的启动子序列的调控下，并将形成的嵌合基因导入到植物中，从而在所述植物中实现对所述真菌病原体的疾病抗性。本发明还允许通过遗传或免疫方法在其它植物中筛选类似的易感性作用应答(SRR)遗传序列，用于发展或增强重要的商业和经济作物的抗真菌特性。
因此本发明的一个方面包括含有能应答于宿主植物和真菌病原体的易感性作用而启动、激活、增强或提高一结构基因表达的核苷酸序列的分离的核酸分子。
在下文中词条“易感性作用应答启动子”或“SRR启动子”、或类似词条用于定义一种在宿主植物或宿主植物细胞和能在所述宿主中形成易感性感染的真菌病原体之间作用之后，可激活或提高一结构基因表达的核酸分子。
文中所涉及的“启动子”应理解为广义的并包括一典型基因组基因的顺式调控序列，其中包括准确的转录起始所需的TATA盒序列，具有或无一CCAAT盒序列和其它调控元件(例如，上游激活序列，增强子和沉默子)，其应答于发育和/或环境刺激，或一组织特异性方式而改变基因的表达。启动子通常位于所调控表达的结构基因的上游或5′端，但并非必须。而且，含有启动子的调控元件通常位于基因转录起始位点的2kb之内。
本发明中，词条“启动子”还用于描述一合成或融合分子或其衍生物，其应答于宿主和真菌病原体的易感性作用而启动、激活或增强一结构基因或其它核酸分子的表达。优选的SRR启动子可含有其它在真菌感染之后可进一步增强表达，和/或改变感染到表达增强所需时间的一种或多种特异性调控元件的拷贝，唯一的要求是SRR启动子为经标准重组技术从天然来源SRR启动子衍生而来。
一般来说，对一个SRR启动子可进行诱变以产生单一或多个核苷酸取代、缺失和/或增加。本发明的SRR启动子序列的核苷酸插入衍生物包括5′和3′末端融合及序列内的单一或多个核苷酸的插入。核苷酸插入序列突变体为一个或多个核苷酸被引入到核苷酸序列中预定的位点，虽然随机插入对于目的产物的适当筛选也是可能的。缺失突变体的特征为从序列中去除一个或多个核苷酸。核苷酸取代突变体为序列中至少一个核苷酸被去除并在其位置上插入一不同的核苷酸。
因此本发明主要涉及应答于宿主植物和真菌病原体的易感性作用而表达上调的典型的基因组基因的SRR启动子序列，其中所述SRR启动子序列由于所述的易感性作用而启动或激活基因的高水平表达。由于所述SRR启动子序列和任何数目的细胞特异性反式作用转录因子的作用而导致在宿主植物和真菌病原体的易感性作用之后所观察到的基因表达的激活为本领域技术人员已知的。但是，本发明中的含有所述SRR启动子序列的核酸分子对于启动任何适当连接的结构基因在植物细胞中的高水平表达是是特别有用的，其中激活的表达应答于易感性作用。成功地实现本发明并不需要分离甚至是知道反式作用转录因子，只要是带有本发明的所述核酸分子的植物产生所述因子即可。
本文所用的词条“结构基因”应理解为广义的，是指含编码一蛋白、多肽或其一部分的DNA片段的基因的转录部分，包括基因的内含子、外显子、5′和3′端非翻译区。一个结构基因可由不间断的编码序列所组成，或者其可包含由植物功能性剪接接头所连接的一个或多个内含子。结构基因可以是多来源衍生的、天然存在或合成的复合体或节段。结构基因还可编码一融合蛋白。
细胞中结构基因的表达由该基因所适当连接的顺式调控序列调控。该顺式调控序列可以是与结构基因同源的或异源的序列。
同源顺式调控序列为适当地连接在原分离来源细胞中特定的结构基因上的调控序列，并未对它进行任何遗传改造。因此，典型的基因组基因包括一适当地连接在一结构基因上的同源顺式调控序列。
下文中，词条“体内遗传性地连接在结构基因上”应理解为是指这样的同源顺式调控序列。
异源顺式调控序列是指适当地连接到没有人工改造时所连接的结构基因之外的结构基因上的顺式调控序列。当一异源顺式调控序列适当地连接到结构基因时，形成的基因通常称为“嵌合基因”。
本领域的技术人员已知从不同种类中分离到的同源基因组基因在结构基因区，特别是其编码区中百分核苷酸序列一致性是最高的。而且，虽然这些同源基因组基因的顺式调控序列可以具有一定的核苷酸序列一致性，但最一致的区域一般限于约6-10个核苷酸的较短长度。然而，作为一个整体的顺式调控序列，长度为2.5kb，其二级结构的特点影响到任何特定的顺式调控序列的整体调控活性。
本发明优选的实施方案提供一种分离到的能应答于植物细胞和真菌病原体的易感性作用而启动或激活结构基因的表达的核酸分子，其中所述核酸分子为体内遗传性地连接到结构基因上的，并与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链有至少40％的一致性。
与SEQ ID NO1所示序列的百分相似性优选地至少为40％。更优选的是，百分相似性至少为60-65％。还更优选的是，百分相似性至少为70-75％。甚至更优选的是，百分相似性至少为80-90％，包括至少91％或93％或95％。
为了命名，SEQ ID NO1所示核苷酸序列为亚麻Fis1结构基因。亚麻Fis1基因组基因一般应答于亚麻植物Linum usitatissimum和亚麻锈菌亚麻栅锈菌间的易感性作用而表达(表1)，例如如文中实施例1中所述的L.usitatissimum cv.Hoshangabad和亚麻栅锈菌CH5。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离到的能应答于植物细胞和真菌病原体的易感性作用而启动或激活结构基因的表达的核酸分子，其中所述核酸分子为体内遗传性地连接到结构基因上的，并在至少低严紧性条件下可与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链杂交。
为了限定严紧性的程度，本文中低严紧性定义为在6×SSC缓冲液和/或0.1％(w/v)SDS中，28℃进行杂交和洗膜。一般来说，严紧性的提高可通过降低SSC缓冲液的浓度，和/或提高SDS的浓度和/或提高杂交和洗膜的温度。杂交和洗膜的条件为本领域技术人员所熟知。为了明确，(影响核酸分子间杂交的参数)，在Ausubel等的2.10.8到2.10.16页数可见参照，其作为参考被本文引用。
更为优选的是，本发明提供了一种分离到的能应答于植物细胞和真菌病原体的易感性作用而启动或激活结构基因的表达的核酸分子，其中所述核酸分子(i)为体内遗传性地连接到结构基因上的，并在至少低严紧性条件下可与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链杂交；和(ii)为体内遗传性地连接到结构基因上的，并与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链有至少40％的一致性。
在本发明一特别优选的实施方案中，提供了一种分离到的能应答于植物细胞和真菌病原体的易感性作用而启动或激活结构基因的表达的核酸分子，其中所述核酸分子含有长度至少为2kb的核苷酸序列，其中所述的序列在5′末端含有SEQ ID NO3所示的序列或其同源序列、类似物或衍生物，在3′末端含有SEQ ID NO4所示的序列或其同源序列、类似物或衍生物。
为了命名，SEQ ID NO3和/或SEQ ID NO4所示的序列是指从亚麻分离的Fis1基因启动子的5和3末端，该启动子能在亚麻锈菌感染后的易感性作用中诱导亚麻Fis1基因的表达。插入在SEQ ID NO3和SEQ IDNO4之间的完整的Fis1启动子核苷酸序列含于一2.2kb DNA片段中，如下实施例5所述。在下面实施例7、8和9的描述中，举例说明了该核酸分子的应用，但不限于此。
更加特别优选的是，本发明的分离到的核酸分子含有可在至少低严紧性条件下与保藏在AGAL保藏号为N96/027087的微生物中所含有的亚麻Fis1基因的SRR启动子序列杂交的核苷酸序列。
可选择地是将根据本发明的这些特别优选的实施方案所分离的核酸分子适当地连接到一结构基因上。
本领域技术人员已知任何结构基因的表达可适当地连接到本发明所分离到的核酸分子，因此，本发明的范围涉及到希望应答于真菌病原体的易感性感染而提高其表达的任何结构基因的应用。
在本发明最特别优选的实施方案中，结构基因为从下组中选择的报告基因，该组包括细菌β-葡糖醛酸酶(uidA或GUS)和氯霉素乙酰转移酶基因和萤火虫荧光素酶基因，或细胞毒素基因，例如芽孢杆菌RNA酶基因或其它编码核酶的基因。
细胞毒素基因及其遗传改造和在转基因植物中表达的方法为本领域中技术人员所熟知。虽然不限于任何相关的理论和作用机制，但当结构基因编码一细胞毒素分子时，在本发明的SRR启动子序列的调控下的所述结构基因在植物中的表达，可应答于所述植物和真菌病原体的易感性作用而被诱导，因而杀死感染部位的植物细胞并阻止真菌病原体向同一植物的其它部位或邻近植物扩散。
本发明还涉及应用本发明的SRR启动子序列调控编码反义或核酶分子的核苷酸序列的表达，其中所述核酶或反义分子能抑制植物生存所需基因的表达。根据该实施方案，与适当地置于SRR启动子序列调控下的细胞毒素基因的作用模式相类似，所述反义或核酶分子的表达将杀死在所述病原体和植物的易感性作用中由侵入的真菌病原体感染的细胞，因而阻止了真菌病原体在感染植物中的继续生长和复制。
本发明还涉及应用本发明的SRR启动子序列调控编码核酶、反义或共抑制分子的核苷酸序列的表达，其中所述核酶、反义或共抑制分子能抑制真菌基因的表达，例如真菌生长和复制所需的真菌基因。根据该实施方案，所述反义或核酶分子的表达将阻止在易感性作用后真菌病原体在感染植物中的继续生长和复制，因而对宿主植物提供了一定程度的保护。
核酶为合成的RNA分子，其含有与两个区互补的杂交区，在靶mRNA中每一个区中至少有5个连续核苷酸碱基。此外，核酶具有高特异性的可自催化剪切靶mRNA的内切核糖核酸酶活性。核酶功能的全面描述由Haseloff和Gerlach(1988)提供，并在国际专利申请号WO89/05852中。本发明涉及编码一SR基因产物的mRNA为靶点的核酶。
反义分子为能与mRNA分子形成双链复合物而阻止其翻译成多肽的核酸分子。
共抑制为当一个或多拷贝的所述基因或一个或多拷贝的基本类似的基因导入到细胞中时所产生的内源基因表达的下降。
本发明特别是涉及一SRR启动子，优选亚麻Fis1基因启动子，它可在亚麻植物Limum usitatissimum和亚麻锈菌亚麻栅锈菌的易感性作用中诱导宿主基因的表达。在亚麻锈菌的易感性作用中诱导基因表达的亚麻SRR启动子序列的例子包括但不限定于亚麻Fis1基因启动子序列。
本发明的主题物明确地包括SRR启动子序列的其它来源，例如，但不限定于谷类植物小麦、玉米、大麦、黑麦、燕麦和稻及其它。根据本发明的这一实施方案，SRR启动子序列的潜在来源和它们在易感性的宿主/锈菌作用中诱导基因表达的非限定例子如表1所示。
在一特别优选的实施方案中，本发明涉及来自玉米Mis1基因的，在玉米和玉米锈菌高粱柄锈菌，特别是玉米和高粱柄锈菌种1的易感性作用中可诱导基因表达的SRR启动子序列。表1多种植物与其相应真菌病原体间易感性相互作用示例病原体宿主植物禾柄锈菌 小麦，大麦和黑麦条形柄锈菌小麦和黑麦隐匿柄锈菌小麦和黑麦大麦柄锈菌大麦禾冠柄锈菌燕麦高粱柄锈菌玉米多堆柄锈菌玉米紫色柄锈菌高粱Puccinia sachari锈菌 甘蔗屈恩氏锈菌甘蔗落花生柄锈菌 花生Puccinia stachmanii锈菌 棉花Uromyces striatus medicaginis条纹单胞锈菌 苜蓿菜豆单胞锈菌 phaseolusHemileia vastatrix咖啡锈菌亚麻栅锈菌亚麻Gymnosporangium juniperi-virginianae桧胶锈菌 雪松和苹果Cronartium ribicola锈菌 白松Cronartium fusiforme锈菌 火炬松和沼泽地松含SRR启动子序列的遗传序列可与天然存在的序列一致，或因一个或多个核苷酸取代、缺失和/或增加而区别。
本领域中可以理解可以对文中所述的SRR启动子分子的特定的增强子和启动子元件的结构安排进行修饰而不破坏提高的基因表达增强活性。例如，可以在选择的植物表达性增强子和启动子元件中进行取代而不明显影响本发明的重组SRR启动子分子的功能。而且，可有利地应用与文中所使用的活性增强子元件同源的核苷酸序列，作为重组启动子结构的取代和插入，以提高应答于用易感性作用的锈病真菌对所述植物的感染的植物细胞中基因的表达。也可通过不同增强子相对于它们之间或相对于TATA盒的位置的排列、取向和间隔可影响SRR启动子序列的功能，这对于本领域中普通的技术人员是可理解的。因此，本发明涉及到SRR启动子序列及其任何功能性启动子、衍生物、部分、片段、同源序列、或类似物，或至少被用作例如分离相似序列的遗传探针，或所述基因的酶法和化学合成中的引物序列，或用于产生免疫活性重组分子的无功能分子。
SR结构遗传序列在分离体内其适当连接的同源SRR启动子是特别有用的。因此，通过应用SR结构基因作为探针或设计PCR引物，来分离SRR启动子序列是可能的，这属于本发明的范围。例如，如本文实施例11所述的，经Fis1结构基因介导，本发明人使用Fis1启动子序列分离相应的玉米Mis1基因。
本发明明显地涉及到至少含有下文所定义的“易感性作用结构基因”或“SR结构基因”的基因编码区的遗传序列，其天然状态下应答于宿主和锈病真菌的易感性作用而表达。文中所涉及的“SR结构基因”应该理解为广义的并包括(i)由转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(例如内含子、5′-和3′-端非翻译序列)组成的典型基因组SR结构基因；或(ii)相应于基因的编码区(例如外显子)和5′-和3′-端非翻译序列的mRNA或cDNA。
词条“SR结构基因”也用于描述编码所有或部分功能性产物的合成或融合基因。优选的SR结构基因可通过标准重组技术从天然来源SR结构基因衍生而来。一般来说，对一个SR结构基因可进行诱变以产生单一或多个核苷酸取代、缺失和/或增加。本发明的SR结构基因序列的核苷酸插入衍生物包括5′和3′末端融合及序列内的单一或多个核苷酸的插入。核苷酸插入序列突变体为一个或多个核苷酸被引入到核苷酸序列中预定的位点，虽然随机插入对于目的产物的适当筛选也是可能的。缺失突变体的特征为从序列中去除一个或多个核苷酸。核苷酸取代突变体为序列中至少一个核苷酸被去除并在其位置上插入一不同的核苷酸。这一取代可以是“沉默的”，因该取代没有改变由密码子所确定的氨基酸。另外，取代可设计为将一氨基酸改变成另一作用相似的氨基酸，或电荷，极性或疏水性类似的氨基酸。
因此，本发明的第二个方面是分离到的含有上文所定义的SR结构基因的核酸序列。
所述SR结构基因优选含有与SEQ ID NO1所示序列一致或互补的核苷酸序列，或具有至少为40％，更优选至少为55％，还更优选至少为65％，还更优选至少为75-80％，甚至更优选至少为85-95％的核苷酸相似性，或其同源序列、类似物或衍生物。
本发明这方面的另一实施方案中，所述核酸分子能在至少低严紧性条件下与SEQ ID NO1所示核酸分子或其互补链杂交。
根据这方面，所述SR结构基因编码或互补于一编码应答于宿主和锈病真菌的易感性作用而表达的多肽的序列。
在一特别优选的实施方案中，所述SR结构基因为编码SEQ ID NO2所示氨基酸序列的如SEQ ID NO1所示的亚麻Fis1基因，或其同源序列、类似物或衍生物。
SR结构基因作为分子标记在鉴定可应答于真菌病原体的易感性感染而表达的同源核酸分子中特别有用。SR结构基因的这一作用来自于它一般由SRR启动子序列调控下表达这一事实，例如亚麻Fis1启动子序列，因此，细胞中同源基因的表达应答于所述真菌感染而上调。这样，SR结构基因可用于检测能与之杂交的或其至少10个连续核苷酸在至少低严紧性条件下可与之杂交的任何SR结构基因的表达上升。
因此，本发明在其它方面提供了一种检测由能与一植物形成易感性作用的真菌病原体的感染的方法，所述方法包括检测所述植物中SR结构基因表达上升的步骤。
所述的检测表达上升的步骤优选地通过用含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或来自其中的长度至少为10个连续核苷酸片段的第二种核酸分子在一定条件下接触来自所述植物的核酸分子一段足以允许形成双链核酸分子的时间来进行。
更为优选的是，第二种核酸分子用如放射性或生物素化分子、酶、抗体或任何其它可经已知方法分析的报告分子标记。根据该实施方案，杂交步骤中结合的核酸分子的量可经结合的报告分子的量的测定而分析。
根据本发明这一方面的方法可特别应用于检测植物中真菌病原体的感染，其中所述植物和相应的真菌选自表1中所示的病原体宿主植物组合。
本发明的SRR启动子序列和/或SR结构基因遗传序列还可用于所述相关的SRR启动子序列和SR结构基因从其它植物中的分离。当本发明的SRR启动子序列和相关序列之间的核苷酸序列一致性的程度足够高时，SRR启动子直接用作杂交探针是可行的。但是，当本发明的SRR启动子序列和功能相关的SRR启动子之间不具备足够高的核苷酸序列相似性时，可首先分离相关的SR结构基因和/或其相当的基因组克隆然后用于分离相关的SRR启动子序列。
根据本实施方案，建立以鉴定一相关的SRR启动子序列或SR结构遗传序列的方法，所述的方法包括用可杂交量的第一种SRR启动子序列或第一种SR结构基因或其一部分接触基因组DNA或mRNA或cDNA或其部分片段、或其来源，并接着检测所述杂交。
相关的SRR启动子序列或SR结构遗传序列可以是重组形式，位于病毒颗粒、噬菌体颗粒、酵母细胞、动物细胞、或植物细胞中。相关的遗传序列优选来源于Triticum aestivum或类似的植物，如大麦、黑麦、燕麦、玉米或稻和/或野生品种和/或杂交种或衍生种和/或其原始祖先。另外，相关的遗传序列可结合到支持基质上，如尼龙、硝酸纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖及其它。
第一种SRR启动子序列或第一种SR结构遗传序列优选来自亚麻、或其它植物如小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米或稻。
SR结构基因优选包括能在至少低严紧性条件下与SEQ ID NO1所示序列或其互补、同源、类似物或衍生物杂交的核苷酸序列。
在一特别优选的实施方案中，SRR启动子序列含有长度至少为2kb的核苷酸序列，其中所述的序列在5′末端含有SEQ ID NO3所示的序列或其同源序列、类似物或衍生物，在3′末端含有SEQ ID NO4所示的序列或其同源序列、类似物或衍生物。
更加特别优选的是，第一种SRR启动子序列含有可在至少低严紧性条件下与保藏在AGAL保藏号为N96/027087的微生物中所含有的亚麻Fis1基因的SRR启动子序列杂交的核苷酸序列。
SRR启动子序列或SR结构基因优选用能产生可检测信号的报告分子(放射性同位素如32P、或35S、或生物素化分子)标记，以实现其在相关SRR启动子序列和SR结构基因的分离中用作杂交探针的用途。
为了限定严紧性的程度，本文中低严紧性定义为在6×SSC缓冲液和/或0.1％(w/v)SDS中，28℃进行杂交和洗膜。一般来说，严紧性的提高可通过降低SSC缓冲液的浓度，和/或提高SDS的浓度和/或提高杂交和洗膜的温度。杂交和洗膜的条件为本领域技术人员所熟知。为了明确，(影响核酸分子间杂交的参数)，在Ausubel等(1987)的2.10.8到2.10.16页数可见参照，其作为参考被本文引用。
另外，一种与SEQ ID NO1所示的亚麻Fis1结构基因相关的SR结构基因和/或与其相当的基因组克隆的分离可通过应用衍生自SEQ ID NO1的寡聚核苷酸引物，利用聚合酶链反应(PCR)来扩增。本发明中使用的聚合酶链反应方法包括长度至少为10个核苷酸的核酸引物杂交到核酸“模板分子”上，所述模板分子在本文中定义为SRR启动子序列、或SR结构遗传序列、或其功能性部分、或其互补序列。随后，相关的SRR启动子可直接从所述的基因组克隆中分离或通过使用相关的SR结构基因作为探针进行杂交。这些方法对于本领域中技术人员是已知的。
核酸引物分子或用于杂交的分子可含在其它核酸引物分子的水相混合物中，或以基本纯的形式存在。
在一优选的实施方案中，核酸引物分子含有来自SEQ ID NO1、3、4、5、6或7中任一所示的亚麻Fis1序列的至少10个连续核苷酸。为了命名，SEQ ID NOs5-7每一个含有一编码表2所示的SR基因产物基元的、或与之互补的核苷酸简并序列。
更为优选的是，所述寡聚核苷酸分子含一基本上与SEQ ID NO5、SEQID NO6或SEQ ID NO7相同的核苷酸序列或其同源序列、类似物或衍生物。
核酸模板分子可以是重组形式，含于病毒颗粒、噬菌体颗粒、酵母细胞、动物细胞、或植物细胞中。相关的遗传序列优选来源于Triticumaestivum或类似的植物，如大麦、黑麦、燕麦、玉米或稻和/或野生品种和/或杂交种或衍生种和/或其原始祖先。
在一特别优选的实施方案中，本发明提供一来自SEQ ID NOs1、3和4任一所示核苷酸序列或其同源序列、类似物或衍生物的可用作杂交探针或PCR引物的核苷酸序列。
更为优选的是，所述寡聚核苷酸分子包含一基本上与SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQ ID NO7相同的核苷酸序列或其同源序列、类似物或衍生物。
本发明的其它方面是指含前文所定义的SRR启动子序列或其同源序列、类似物或衍生物的遗传结构。
SRR启动子序列或其功能性衍生物、部分、片段、同源序列、或类似物可用于调节异源结构基因的表达，如报告基因或编码细胞毒素的基因，或者，它可调节编码核酶或反义分子的核酸分子的表达。
置结构基因于SRR启动子调控之下是指定位该结构基因使其表达由这些启动子序列调控。启动子一般定位于其所调控的基因的5′端(上游)。在异源启动子/结构基因重组子的结构中，一般优选定位启动子离基因转录起始位点一定距离，这一距离大约与启动子和其在天然状态下所调控的基因(启动子所来自的基因)的距离相似。如本领域已知的，这一距离上的某些并不丧失启动子功能的改变是允许的。类似地，涉及到由其调控的异源基因的调控序列元件的优选定位是其天然状态下的定位(启动子所来自的基因)。还有，如本领域已知的和文中以多拷贝调控元件证实的那样，这一距离可以发生某些改变。
优选的报告基因包括包括β-葡糖醛酸酶和氯霉素乙酰转移酶基因和萤火虫荧光素酶基因及其它，优选的细胞毒素基因包括芽孢杆菌RNA酶基因或其它核酶基因。
细胞毒素基因或核酶或反义分子可以是任何上文讨论的基因，当在植物细胞中产生时，可杀死、灭活或排斥真菌，或杀死或至少明显改变宿主细胞代谢以限制所述真菌的传播和/或发展。
SRR启动子序列优选含长度至少为2kb的核苷酸序列，其中所述的序列在5′末端含有SEQ ID NO3所示的序列或其同源序列、类似物或衍生物，在3′末端含有SEQ ID NO4所示的序列或其同源序列、类似物或衍生物。
更加特别优选的是，第一种SRR启动子序列含有可在至少低严紧性条件下与保藏在AGAL保藏号为N96/027087的微生物中所含有的亚麻Fis1基因的SRR启动子序列杂交的核苷酸序列。
在最特别优选的实施方案中，本发明的遗传结构含有适当地连接到亚麻Fis1启动子序列的GUS报告基因，例如图2a所示并保藏于AGAL保藏号为N96/027087的pFisGUS52遗传结构。
本发明的其它方面还涉及带有如上文所定义的非内源SRR启动子序列和/或SR结构遗传序列的转基因植物，如作物植物。优选的SRR启动子序列或SR结构遗传序列与亚麻Fis1核苷酸序列基本一致，或从其衍生。
转基因植物优选为亚麻植物。转基因植物更优选下列的一种或多种亚麻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、稻、玉米或其它。并不排除其它品种。
在最特别优选的实施方案中，转基因植物为用保藏于AGAL保藏号为N96/027087的遗传结构转化的亚麻植物。
转化植物组织的方法对于本领域的技术人员是已知的。给定的植物品种或特定类型的植物组织所使用的技术将取决于已知的成功技术。导入重组DNA到植物组织的方法包括但并不限定于转化(Paszkowski等，1984)、电穿孔(Fromm等，1985)、或DNA微注射(Crossway等，1986)或T-DNA-介导的从土壤杆菌到植物组织的转移。代表性的T-DNA载体系统如下列参考文献中所述An等(1985)；Herrera-Estrella等(1983a，b)；Herrera-Estrella等(1985)。一旦导入到植物组织中，结构基因的表达可在瞬时表达系统中分析，也可在筛选稳定整合在植物基因组中之后确定。植物组织的体外培养和整个植物的再生的技术是已知的。将导入的基因从原始转化植物转移至具有商业用途的培养物中的方法对于本领域的技术人员是已知的。
本发明涉及来自所述转基因植物的后代。
本发明的另一方面保证了在适当的宿主(如原核或真核细胞)中表达SR结构基因以生成全长或非全长的重组SR基因产物。
SR基因产物还优选包括2种、还更优选3种和甚至还更优选4种包含在表2中所示目录中的氨基酸基元。SR基因产物优选其序列至少与SEQ IDNO2中所示氨基酸序列或其同源序列、类似物或衍生物有至少40％的一致性。在特别优选的实施方案中，SR基因产物含与SEQ ID NO2中所示亚麻Fis1多肽序列基本一致的氨基酸序列。
本发明还涉及SR基因产物的、优选SEQ ID NO2中所示SR基因产物的合成肽片段。表2SR基因产物基元基元 氨基酸序列GPL WPFGPVAIITPFNFPLEIPVLQLMGALYMGNKPLLKVGSG RMTLFTGSSRVAEKLALDLKGRIKLEDGQG DAYACSGQKCSAQSILFMHEEEP NYELVTKEIFGPFQVVTEYKNSQLPMVLEA在另一实施方案中，本发明涉及含与选自表2所示目录中的氨基酸序列基元相比至少40％相似，或优选40-60％相似，或更优选60-90％相似，或还更优选90-100相似的氨基酸序列基元的SR基因产物。
本发明还涉及含任何关系的重组、或重现、或其功能性衍生物形式的选自表2所示目录中的氨基酸序列基元的、与其具有至少40％的一致性的重组基因产物。
根据这一方面，本发明的重组SR基因产物，或其功能性衍生物可用于制备免疫学作用分子，如抗体，或其功能性衍生物，唯一的要求是重组产物和完整或部分SR基因产物的抗体有免疫学反应。
重组SR基因产物的抗体对于筛选存在所述基因产物的植物是特别有用的。因此，本发明的另一方面涉及重组SR基因产物或其部分或片段的抗体。这一抗体可以是单克隆的或多克隆的，可来自天然生成的SR基因产物的抗体或可以是特定地针对重组SR基因产物而产生的。在后一种情况，SR基因产物首先需要和载体分子结合。另外，抗体的片段也可以使用，如Fab片段。而且，本发明涉及重组和合成抗体和抗体杂合体。“合成抗体”在本文中被认为是包括抗体的片段和杂合体。本发明的抗体和/或重组SR基因产物在免疫学筛查各种植物中SR基因产物，并因此而分离相关的SRR启动子序列和SR结构基因中是特别有用的。
在一实施方案中，特异性抗体用于筛查植物中的SR基因产物。文中所设想的分析技术在本领域中是已知的，包括但并不限于夹心分析法和ELISA。
本发明的范围包括任何针对上述第一抗体的第二抗体(单克隆、多克隆或抗体的片段)。第一抗体和第二抗体一起可用于分析检测或第一抗体可和商业上可得到的抗人免疫球蛋白抗体使用。文中所涉及的抗体包括针对重组SR基因产物的任何区域的任何抗体。
多克隆和单克隆抗体都可通过用重组SR基因产物免疫而获得，两种类型都可用于免疫分析。获得两种类型抗血清的方法为本领域所熟知。虽然多克隆抗血清较小优选，但是可能以有效剂量的重组SR基因产物或其抗原性的或免疫反应性部分注射适当的实验动物，从动物收集血清并经任何已知的免疫吸附技术分离特异性血清而相当容易的得到。虽然通过这一方法制备的抗体能用于任何类型的免疫分析，但由于产品的潜在异源性而一般不受欢迎。
免疫分析中单克隆抗体的使用为特别优选，因为能大量生产并且产品为同源性。可通过本领域技术人员所熟知的技术经融合永生化细胞系和对免疫原性制品敏感的淋巴细胞来制备产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系(见，例如，Douillard和Hoffman，1981；Kohler和Milstein，1975；Kohler和Milstein，1976)。
确定植物中或更普通的植物提取物中的SR基因产物的存在可通过多种方法完成，如蛋白印迹和ELISA方法。经参考美国专利4,016,043，4,424,279和4,018,653可以发现各种免疫分析技术可以应用。当然，这些包括非竞争类型的单一位点和双位点或“夹心”分析，及传统的竞争性结合分析。这些分析还包括标记抗体直接结合到靶点上。
夹心分析是最为有效和经常使用的分析，并应用于本发明中。夹心分析技术存在多种变体，所有的变体将被包括在本发明中。简单地说，在典型的正向分析中，未标记的抗体固定在固体物质上，待测试的样品与结合的分子接触。经一定适当时间的孵育，以充分保证抗体-抗原复合物的形成，加入对抗原特异的用能产生可检测信号的报告分子标记的第二抗体并孵育，保证时间充分以形成另一抗体-抗原-标记抗体的复合物。任何未反应的材料被洗去，通过观察由报告分子产生的信号来确定抗原的存在。
在这种情况中，第一抗体针对重组SR基因产物，而抗原为植物中SR基因产物。
结果可以通过简单观察可视信号而定性，也可通过与含已知量半抗原的对照样品相比而定量。正向分析的变体包括同时性分析，其中样品和标记抗体同时加入到结合抗体中。这些技术，包括任何已知的较小的改变为本另领域技术人员所熟知。根据本发明，样品可以是含有SR基因产物的样品，并包括粗的或纯化的植物提取物，如叶、根和茎的提取物。
在典型的正向夹心分析中，抗重组SR基因产物的第一抗体可共价或被动地结合到固体表面。典型的固体表面可以是玻璃或聚合物，最常使用的聚合物为纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体表面可以是管、珠、微孔板的圆盘形式或任何其它适于进行免疫分析的表面。结合方法为本领域所熟知，一般包括交联、共价结合或物理吸附，在实验样品的制备中洗涤聚合物-抗体复合物。一份待检测的样品加到固相复合物中并在适当的条件下(如25℃)孵育一定充分的时间(如2-40分钟)，以保证存在于样品中的任何抗原与抗体结合。孵育过程之后，洗涤反应点并干燥，并与针对第一抗体部分的第二抗体孵育。第二抗体连接有可用于指示半抗原和第二抗体结合的报告分子。
另一方法涉及到固定生物样品中的靶分子并将固定的靶点呈现给用报告分子标记的或未标记的特异性抗体。根据靶分子的量和报告分子信号的强度，可通过直接用抗体标记来检测结合的靶分子。另外，将针对第一抗体的标记的第二抗体呈现给靶-第一抗体复合物，以形成靶-第一抗体-第二抗体三级复合物。该复合物可通过报告分子所产生的信号来检测。
本发明所使用的“报告分子”是指利用其化学特性能产生保证抗原结合抗体检测的可分析鉴定信号的分子。检测可以是定性或定量的。在这一分析类型中最常使用的报告分子为酶、荧光团或含放射性核素的分子(如反射线同位素)和化学发光分子。
在酶免疫分析中，酶一般利用戊二醛或过氧化物酶交联到第二抗体上。但是，还存在已被公认的多种不同的交联技术，这些技术对于技术人员是已知的。经常使用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶及其它。选择特定酶所使用的底物以通过相应酶的水解而产生可检测的颜色改变。适用的酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。除了上述的产色的底物，也可以使用能产生荧光产物的产荧光性底物。总之，将酶标记抗体加入到第一抗体-半抗原复合物中，保证结合后并将多余的试剂洗去。然后加入含适当底物的溶液到抗体-抗原-抗体复合物中。底物将与连接在抗体上的酶进行反应，产生一定性的可视信号，应用分光光度法可进一步进行定量，以指明样品中所含的抗原的量。词条“报告基因”还可指使用细胞凝集作用和凝集抑制作用，如乳胶颗粒上的红细胞及类似的。
另外，可将荧光化合物在不改变抗体的结合能力的情况下化学偶联到抗体上，如荧光素和罗丹明。当使用特定波长的光激发时，荧光色团标记抗体吸收光能诱发分子的激发态，随后发射用荧光显微镜可目测的特定颜色的光。当酶免疫分析时(EIA)，荧光标记抗体可结合第一抗体-抗原复合物。洗去未结合的试剂后，将保留的三级复合物暴露于适当波长的光中，所观察到的荧光显示目的半抗原的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中已很好地建立，并特别适用于本方法。但是，其它的报告基因，如放射性同位素、化学发光或生物发光分子也可应用。微生物保藏用含调控GUS报告基因表达的亚麻Fis1基因启动子的载体pFisGUS52转化的于大肠杆菌，根据用于专利申请程序的国际公认微生物寄存布达佩斯条约，于1996年5月3日被保存于澳大利亚国家分析实验室(AGAL)，邮政信箱385，Pymble，新南威尔士2073，澳大利亚，保藏号为N96/027087。
本发明通过以下非限定附图和实施例进一步描述。
在附图中，
图1为一照片，代表证实亚麻基因组中pFIS1来源的一DNA印迹杂交。等量(10ug)的亚麻DNA(1-3泳道)和锈菌DNA(4-6泳道)用限制酶消化，BgIII(1和4泳道)，EcoRI(2和5泳道)，HindIII(3和6泳道)。DNA转至膜上，用pFISl检测。
图2(a)为一图解，为一含有位于亚麻Fis1基因启动子序列控制下的细菌β-葡糖醛酸酶结构基因(uidA)的重组DNA分子。画线区域为Fis1启动子。阴影区域为β-葡糖醛酸酶结构基因。
图2(b)为一照片，代表亚麻Fis1启动子基因控制下GUS报告基因的表达，该表达在亚麻栅锈菌感染后、携带图2(a)所示重组DNA分子的转基因亚麻植物的叶细胞中进行。X-葡糖苷酸染色后GUS基因表达在植物细胞中呈广泛兰染，该范围在图中为黑点区。申请人可随时提供原始染色记录。
图3为一照片，代表一显示易感性锈菌感染中FislmRNA水平的RNA印迹杂交。每一泳道含20ug总RNA，分别从萌芽的锈菌孢子(1)，接种锈菌孢子1天后的易感性亚麻植物叶(2)，接种2天后叶(3)，3天后叶(4)，4天后叶(5)，5天后叶(6)，6天后叶(7)和未感染的叶子(8)中分离。箭头表示大、小核糖体RNA的位置。
A)滤膜与Fis1结构基因编码区杂交。
B)为证实负载了等量的RNA，与A中相同的滤膜与亚麻cDNA与在感染过程中无改变的pFCS1(亚麻稳定序列FCS)杂交(注意暴露时间为pFIS1检测时的5倍)。
C)相同滤与一克隆的阴离子过氧化物酶cDNA杂交(见材料与方法中过氧化物酶克隆的完整描述)。
图4为一照片，代表显示一亚麻锈菌抗性感染过程中Fis1 mRNA水平的RNA印迹杂交。每一泳道含20ug总RNA，分别从接种5天后的易感性植物叶(1)及未感染(2)、接种1天后(3)、2天后(4)、3天后(5)、4天后(6)、5天(7)后抗性亚麻叶中分离。
A)滤膜与pFIS1杂交。
B)相同滤膜与一阴离子过氧化物酶cDNA杂交以证实抗性感染过程中此PR蛋白的诱导。
C)与A中相同的滤膜用亚麻cDNA pFCS1检测，用作证实各泳道结合量相同的对照。
图5为一图解，表示一玉米Mis1(第一行)与亚麻Fis1(第三行)SR基因产物基元的氨基酸序列比较，包括GPL基元，GSG基元，EEP基元，和结合了GQG基元的活性位点。每例的第二行表示保留的氨基酸残基，符号(+)指示保守氨基酸置换。
图6为一照片，表示高粱柄锈菌种1感染易感性玉米植物后5天内mRNA诱导的一northern印迹杂交。每一泳道约含30ug总RNA，分别从未感染植物(泳道1)或感染2、3、4或5天后收获的感染植物叶(分别于2-5泳道)中分离。
图7为一照片，表示一Mis1序列在标准严格杂交条件[插入条件]下检测的northern印迹杂交。每一泳道约含10ug NcoI消化的总基因组DNA，分别从Franklin大麦(泳道1)，Himalaya大麦(泳道2)，Ascenceo燕麦，Victoria燕麦(泳道4)，中国春季小麦(泳道5)，Tx303玉米(泳道6)，CO159玉米(泳道7)的幼苗中分离。
本说明书中氨基酸残基的单字母和3字母缩写见表3。表3氨基酸3字母缩写单字母代号丙氨酸Ala A精氨酸Arg R天冬酰胺 Asn N天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸Glu E甘氨酸Gly G组氨酸His H异亮氨酸 Ile I亮氨酸Leu L赖氨酸Lys K蛋氨酸Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸Pro P丝氨酸Ser S苏氨酸Thr T色氨酸Trp W酪氨酸Tyr Y缬氨酸Val V
实施例1植物材料和锈菌菌株所有的用锈菌CH5株的易感性感染都是对12天龄的亚麻幼苗(Limumusitatissimum cv.Hoshangabad)进行。将新鲜芽孢撒在幼苗上并保证在湿化环境中于20℃萌发过夜。对于抗性感染，亚麻幼苗(L.usitissimum cv.Forge，Ellie等，1992)作为锈菌CH5株的宿主。
实施例2从亚麻幼苗中提取RNA和DNA在液氮中将亚麻幼苗叶磨碎并悬浮于20mM TRIS pH7.5，100mM NaCl，2.5mM EDTA，1％SDS，0.5％2-巯基乙醇(5ml/g)中。经酚∶氯仿∶异戊醇抽提3次，以去除蛋白。用等体积的异丙醇沉淀总核酸，离心收集并重悬于TE(maniatis等，1982)中。加入固体NaCl到终浓度为3MNaCl，将RNA从DNA和污染的糖类中沉淀出来。以相似的方法提取DNA，只是在沉淀总核酸之后，经CsCl密度梯度纯化DNA(Maniatis等，1982)实施例3一个易感性应答cDNA的分离如实施例1和2所述，从用锈菌芽孢重度感染的亚麻叶中提取总RNA。用寡聚d(T)磁珠纯化多聚A+RNA，并应用含1个NotI限制性位点的寡聚d(T)引物分子(GGCCGATGCGGCCGC(T)17)作为cDNA合成的引物，进行逆转录。锈菌感染的叶子特有的cDNA序列经与10μg生物素化的来自未感染亚麻叶的多聚A+RNA的减法杂交加以富集。该减法过程进行3次之后，纯化的cDNA序列应用dATP和末端转移酶(BRL，Gainsville，FL USA)在3′-端加尾。随后，经聚合酶链反应扩增该cDNA序列并作为NotIDNA片段克隆到质粒pGEM5(Promega，Madison，WI USA)中。
7个单一的cDNA克隆被分离，其可在未感染的亚麻叶中低水平表达。一个cDNA克隆pFIS1的表达可经锈菌芽孢对亚麻叶的感染所诱导，因此认为其与SR结构性遗传序列相一致。该Fis1结构基因的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
实施例4SR结构基因Fis1是一亚麻遗传序列为了证实前文实施例3的cDNA pFIS1为一来自亚麻植物的遗传序列，而并非来自亚麻锈菌，从亚麻和锈菌生物中提取DNA并与pFIS1中cDNA的插入物进行杂交。
如
图1所示，pFIS1与亚麻DNA杂交并不与锈菌DNA杂交，这证实了pFIS1是来自亚麻基因，定义为fis1。简单的杂交模式推测fis1为一低拷贝数的基因。在HindIII和BglII消化物中存在两条杂交带。因为所用的pFIS1探针不存在这些限制性内切酶识别位点，所以，这些结果与存在两个与pFIS1同源的基因相一致。
实施例5Fis1基因启动子的分离利用前文实施例3和4的SR结构性遗传序列作为杂交探针，分离到一含2.2kb SRR启动子片段的基因组克隆。应用来自FIS1 cDNA的5′末端探针(NruI/AccI片段)对λ基因组文库进行筛选。根据其BglII和AccI的限制性酶切图谱(FIS1中295位存在一AccI位点，1143位存在一BglII位点)，以及将插入的大小与当基因组DNA用BglII和AccI酶切时所得到的片段进行比较，筛选能与该5′末端探针杂交的基因组克隆。在基因组DNA中，存在两个可与5′末端探针杂交的片段。得到的6个基因组克隆根据其BglII和AccI的限制性酶切图谱分成两类。含有可杂交DNA的BglII片段亚克隆至一质粒载体(Bluescript)并从每一个末端得到部分序列的数据。序列分析(从内部的BglII位点)显示这两类克隆的序列中，一类与Fis1 cDNAl00％相似，另一类仅为95％。100％相似的序列之一用于如下实施例7所述构建与大肠杆菌β-葡糖醛酸酶(GUS)基因融合的启动子。该Fis基因启动子的5′末端和3′末端已测序，核苷酸序列分别如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。
实施例6Fis1遗传序列的核苷酸序列分析应用Applied Biosystems双链DNA测序系统(Perkin-Elmer，CA，USA)进行DNA测序。应用Wisconsin GCG软件包分析序列。
Fis1 cDNA克隆pFIS1的序列数据表明SEQ ID NO1的核苷酸57为一ATG翻译起始密码子。pFIS1中所发现的最长的开放读码框架(1653碱基对)具有551个氨基酸，其预期分子量约为约61kDa。
Blocks(v6.0)和Prosite数据库(Henikoff和Henikoff，1991)的保守蛋白序列基元的检索表明SEQ ID NO1所示的Fis1基因产物的氨基酸序列具有许多在醛脱氢酶中所发现的保守序列基元(Hempel等，1993)。Cys-332附近的氨基酸残基与在所有的醛脱氢酶中所发现的半胱氨酸活性位点的共有序列(Henikoff和Henikoff，1991)相匹配。除了该“半胱氨酸活性位点”，Blocks检索发现另外3个也能在醛脱氢酶中发现的序列基元，如表2所示。Black数据库检索给出的p值大约为p＜7.8e-07，1450的“混匀”(shuffled)值＝醛脱氢酶数据组的99.86％。被鉴定的第一个这种氨基酸序列在Gly-193和Lys-226之间，已知为GPL基元。第二个是Phe-276和Ala-282之间的GSG基元。第三个基元是Lys-435和Pro-550间的EEP基元。FIS1 GPL基元序列与大肠杆菌脯氨酸脱氢酶多肽之间的比较表明两个序列在192-225氨基酸中有50％的相似性(36/71个氨基酸)。亚麻FIS1和大肠杆菌脯氨酸脱氢酶多肽之间GSG基元和EEP基元中的相似性分别为65％和50％。FIS1蛋白的相对大小也与其为一种醛脱氢酶相一致。已知存在于除甲基丙二酸-半醛脱氢酶亚类外的醛脱氢酶中的一种含谷氨酸序列FGS基元也未出现在FIS1中。
实施例7一Fis1/GUS遗传结构在转基因植物中的表达细菌β-葡糖醛酸酶结构基因被适当地置于SSR启动子序列的调控下，该启动子与上述实施例5和6的亚麻Fis1基因启动子相一致，如图2a所示。
二元植物转化载体pBI101作为GUS基因的来源。pBI101用BamHI酶切，然后用大肠杆菌DNA多聚酶Klerow片段补平，以形成平端。该平端接着用XbaI酶切，形成一具有一5′XbaI末端和一3′平端(GUS末端)的质粒。从基因的Nru1位点到bluescript载体的XbaI位点的Fis1基因的2kb5′末端区，连接到质粒pBI101中。这导致另外的43个来自Fis1编码区的氨基酸加到GUS蛋白中。形成的质粒命名为pFisGUS52并显示于图2(a)，其已寄存于AGAL，保藏号为N96/027087。
然后根据本领域已知的土壤杆菌介导的转化方法将遗传结构导入到亚麻植物中。在含卡那霉素的培养基中筛选转基因植物。经在10mM磷酸缓冲液，0.5MM K高铁氰化物，0.5mM K亚铁氰化物，1mM X-葡糖苷酸中，37℃浸润过夜，检测再生植物的GUS活性。T2转基因植物的叶用锈菌感染4天，然后进行GUS染色以显示表达的模式。如图2(b)所示，GUS基因可在真菌病原体易感性作用中所感染的细胞内表达。未感染细胞没有显示可检测的GUS基因表达。
实施例8在易感性锈菌感染过程中亚麻Fis1基因表达的分析应用标准的变性甲醛凝胶(Maniatis等，1982)电泳亚麻RNA，以分离10或20μg的总RNA。然后用20×SSC将RNA转移到Hybond N膜(Amersham International，UK)上。应用Megaprime系统(Amersham)，用[α-32P]dCTP标记DNA探针。杂交到膜上的32P-探针的量用PhosphorImager(Molechlar Dynamicas，CA USA)进行定量，使用的数据来自三个独立的实验。
经亚麻锈菌CH5感染后，与Hoshangabad亚麻mRNA杂交的pFIS1 cDNA明显增加(图3A)。pFIS1 mRNA的增加与锈菌感染的发展平行。在感染的早期阶段(接种1和2天)，RNA的水平几乎没有改变。后来(接种5-6天)，当许多叶肉细胞被锈菌感染时，与pFIS1同源的mRNA水平增加10倍，和预期的一种SSR结构基因的诱导模式相一致。但是图2b所示数据表明叶对这一表达上10倍的总体提高的细胞数目是较小的，说明每个细胞中Fis1基因诱导的确切水平远远大于10倍。十分明显，从全部叶子所观察到的10倍诱导受到大量的并未发生诱导的细胞的明显的稀释作用。
Fis1 mRNA的大小约为1.9kb。为了检测RNA的上样量是基本相等的，应用一种mRNA不发生改变的低丰度cDNA(pFCS1亚麻对照序列)进行检测同样的RNA印迹(图3B)。接种6天后的叶中，检测到杂交略为降低。这一轻微的下降可能反映了由真菌RNA比例的增加所引起的稀释作用，因而导致植物转录本的稀释。
实施例9抗性锈菌感染并未诱导SR结构基因Fis1的表达为了确定抗性锈菌感染是否诱导SR结构基因Fis1的表达，使用pFIS1cDNA插入作为杂交探针，如前面的实施例中所述对用亚麻锈菌CH5感染的Forge亚麻进行RNA杂交。
在抗性作用时，5天后所观察的fis1 mRNA水平没有提高。相反，在抗性感染的非常早期的阶段，可观察到对照阴离子过氧化物酶mRNA的水平提高5倍(平均)(图4B)。Fis1 mRNA的积累模式与典型PR蛋白基因的诱导模式不同。这些数据和实施例8的数据表明SR结构基因Fis1由与在所述宿主和锈病真菌的抗性作用中调节宿主细胞基因表达的细胞机制截然不同的机制所调节。
实施例10与亚麻Fis1基因同源的玉米基因的分离为了分离与亚麻cDNA(pFIS1)类似的玉米cDNA，设计了针对亚麻蛋白(FIS1)的两个区(表2所示的GPL和EEP基元)的简并寡聚核苷酸引物。所用的寡聚核苷酸的核酸序列如SEQ ID No5，6和7所示。
然后利用Taq聚合酶加上的“A突出端”将片段克隆至Promega载体pGEM-T中。
根据Fis1结构基因序列，扩增产物的预期大小约为700bp。但是，PCR反应至少产生3个额外的DNA片段，2个比预期的700碱基对小的和1个大的片段用于进行进一步的实验，因为已假定这些片段在与FIS1相同的位置上具有GPL和EEP基元。
用玉米RNA合成用于PCR的模板cDNA，从用玉米锈菌的易感性感染6天后的6周龄玉米中提取玉米RNA。在合成cDNA之前，应用Promega提供的条件，用无RNA酶的DNA酶(DnaseQ)处理总RNA。该逆转录反应使用了20μg总RNA，以200μg寡聚d(T)为引物，应用New England Biolabs的MMV逆转录酶在25μl的反应体系中按推荐的条件进行。逆转录之后，0.5μl的反应产物用于一20μl的PCR反应。PCR的条件如下，10mM KCl，10mM Tris pH8.3，1.5mM MgCl，2μM每种引物，2mM每种dNTP和1单位的Boehhringer Mannheim的Taq聚合酶。循环参数为(94℃，1分钟；45℃，30秒；73℃，2分钟)6×；(94℃，10秒；45℃，20秒；73℃，2分钟)32×；(94℃，20秒；45℃，20秒；73℃，3.5分钟)1×，使用Corbett Research热循环仪。引物为，EEP＝5′AAA/g GAA/gATA/t/c TTT/c GGI CCI TT 3′(SEQ ID NO5)和GPL＝5′ATA/t/c ACICCI TTT/c AAT/c TTT/c CC 3′(SEQ ID NO6)(I＝次黄嘌呤核苷)。
PCR反应产物在TBE，1％琼脂糖凝胶上分离并应用Qiagen凝胶提取试剂盒从凝胶中洗脱700碱基对片段。
然后将700碱基对的PCR产物使用ABI自动测序仪进行测序。该序列用于在数据库中检索相似序列。与玉米序列最匹配的是亚麻基因Fis1。Blast值为494，与p5C脱氢酶(1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶、枯草芽孢杆菌的一种醛脱氢酶)相比，为第二高值90。在核苷酸水平上，Mis1结构基因的633核苷酸72％与亚麻Fis1结构基因一致，在氨基酸水平上，Mis1结构基因的204氨基酸的84％与亚麻Fis1结构基因一致。所得的玉米Mis1和亚麻Fis1多肽的比较见图5。
实施例11高粱柄锈菌种1易感性作用中玉米SR结构基因Mis1的表达应用标准的变性甲醛凝胶(Maniatis等，1982)电泳玉米RNA，以分离30μg的总RNA。然后用20×SSC将RNA转移到Hybond N膜(AmershamInternational，UK)上。应用Megaprime系统(Amersham)，用[α-32P]dCTP标记DNA探针。杂交到膜上的32P-探针的量用Phosphor Imager(Molechlar Dynamicas，CA USA)进行定量，使用的数据来自三个独立的实验。
经高粱柄锈菌种1感染后，与Hoshangabad亚麻mRNA杂交的pFIS1 cDNA明显增加(图6)。所观察的Mis1mRNA的增加和预期的一种SR结构基因的诱导模式相一致。
实施例12与Fis1和Mis1相关基因的进一步鉴定为了确定其它谷物作物植物种类是否含有与Fis1和Mis1相关的SRR启动子和SR结构基因，从大麦、燕麦、小麦和玉米幼苗分离的基因组DNA转移到支持膜上并有Mis1 SR结构基因序列杂交。
结果显示在所有检测的种类中都含有如Fis1和Mis1的SR调控基因(图7)。其它植物中这些序列的证实提供了其随后分离的方法，这一点本领域技术人员是明了的。
实施例13转基因植物中由Fis1启动子所调控的芽孢杆菌RNA酶基因的表达通过用芽孢杆菌RNA酶基因的编码区代替如上“实施例7”所述的存在于二元载体的GUS基因，使芽孢杆菌RNA酶结构基因被适当地置于Fis1启动子序列的调控下。这些方法为本领域普通技术人员所熟知的方法，而不用过多的实验。
然后按实施例7所述的土壤杆菌介导的转化方法，将含有适当地置于Fis1启动子下游的芽孢杆菌RNA编码区的目的遗传结构导入到Hoshangabad亚麻植物中。在含卡那霉素的培养基中筛选转基因植物。应用常规的northern杂交、RNase保护或PCR方法检测芽孢杆菌RNA酶基因的表达。
然后用可与宿主植物形成易感性作用的亚麻锈菌，特别是CH5株，感染再生的转化植物，以确定转基因植物是否表现为对亚麻锈菌的抗性提高。应用相似年龄和在一致的生长条件下，非转化等基因亚麻植物作为对照。
在亚麻栅锈菌易感性作用后，由亚麻Fis1基因启动子调控下芽孢杆菌RNA酶基因的表达为转基因植物提供了统计学显著意义的保护(p＜0.05)。特别是，虽然非转化对照植物和转化植物的感染速度在感染后前24小时是相似的，但在感染后14天转化植物的病变程度明显减轻，并且转化植物很快地恢复了活力。因此，在如Fis1的SRR启动子序列调控下表达细胞毒素基因的方法可用于提供抗易感性作用真菌病原体的保护。
本领域的技术人员了解除了那些特定的描述外，本文所述的发明易于改变和修饰。应该理解为本发明包括所有这些改变和修饰。本发明还包括本专利说明书所涉及和指明的所有步骤、特点、配方和化合物，单独地或作为一个整体，及任何和所有的任何两个或更多步骤或特征的组合。参考文献1.An等(1985)，EMBO杂志，4277-284。2.Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K.等(1987)，现代分子生物学方法，WileyInterscience(ISBN047140338)。3.Collinge，D.B.和Slusarenlo，A.J.(1987)，植物分子生物学，9389-410。4.Crossway等(1986)，分子基因遗传学，202179-185。5.Dixon，R.E.和Lamb，C.J.(1990)，植物生理与植物分子生物学年报，41339-367。6.Douillard和Hoffman(1981)，杂交瘤的基本事实。见免疫学纲要，第二卷(编辑Schwarz)。7.Ellis，J.G.，Finnegan，E.J.和Lawrence，G.J.(1992)遗传学理论及应用，8546-54。8.Fromm等(1985)美国科学院院报，825824-5828。9.Hasiloff，J.和Gerlach，W.L.(1988)，自然，334586-594。10.Hempel，J.，Nicholas，H.和Lindahl，R.(1993)，蛋白科学，21890-1900。11.Henikoff，S.和Hemikoff，J.G.(1991)，核酸研究，196565-6572。12.Herrera-Estrella等(1993a)，自然，303209-213。13.Herrera-Estrella等(1983b)，EMBO杂志，2987-995/14.Herrera-Estrella等(1985)，见植物遗传工程，剑桥大学出版社，纽约，pp63-93。15.Keen，N.T.(1992)，植物分子生物学，19109-122。16.Kohler和Milstein(1975)，自然，256495-499。17.Kohler和Milstein(1976)，欧洲免疫学杂志，6511-519。18.Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.(1982)，分子克隆实验室手册，冷泉港，纽约冷泉港实验室。19.Marineau，C.，Matton，D.P.和Brisson，N.(1987)，植物分子生物学，9335-342。20.Ohashi，Y.和Ohshima，M.(1992)，植物细胞生理，33819-826。21.Pazkowski等(1984)，EMBO J.，32717-2722。22.Sutton，B.C.S.和Shaw，M.(1986)，加拿大植物学杂志，6413-18。23.van Loon，L.C.(1985)，植物分子生物学，4111-116。
序列表(1)一般信息(i)申请人联邦科学及工业研究组织和澳大利亚国立大学(ii)发明名称真菌感染激活的植物启动子(iii)序列数7(iv)通信地址(A)收信人DAVI ES COLLISON CAVE(B)街道小COLLINS街1号(C)城市墨尔本(D)州维多利亚(E)国家澳大利亚(F)ZIP3000(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MC-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，#1.25版本(vi)本申请资料(A)申请号国际PCT(B)申请日1996，5，3(vii)优先申请资料(A)申请号AU PN 2834/95(B)申请日1995，5，5(viii)律师/代理人资料(A)姓名SLATTERY MR，JOHN M(B)参考/卷号JMS/MRO(ix)电信信息(A)电话+61 3 254 2777(B)传真+61 3 254 2770(C)电报AA31787(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度1853bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)特征(A)名称/关键CDS(B)定位54..1706(iv)序列描述SEQ ID NO1ATCAGAGGTC GCCATAGAGA TCATTTCCAC TCCAATCAAG CCCTCTGACC ATC ATG 56Met1TAC AGG CCA CTT GTT GCC AGG TTG CTG CGA GAC AGC GTC GCT ACC CGA 104Tyr Arg Pro Leu Val Ala Arg Leu Leu Arg Asp Ser Val Ala Thr Arg5 10 15AAG GGC TCG TCC CAT TTC GCC CGG AGG TTT TCT CAT TCT TTG CCC TTC 152Lys Gly Ser Ser His Phe Ala Arg Arg Phe Ser His Ser Leu Pro Phe2O 25 30GCG ACC GTA GAT GCG GAG GAG CTA TCT GGT GCT AAA CCA GCT GAA GTG 200Ala Thr Val Asp Ala Glu Glu Leu Ser Gly Ala Lys Pro Ala Glu Val35 40 45CTT AAC TTG GTT CAG GGG AAT TGG GGA GGT TCT TCC AGT TGG CAC ACG 248Leu Asn Leu Vai Gln Gly Asn Trp Gly Gly Ser Ser Ser Trp His Thr50 55 60 65GTG GTT GAT CCT TTA AAC GGA GAA CCG TTT ATC AAA GTT GCT GAA GTA 296Val Val Asp Pro Leu Asn Gly Glu Pro Phe Ile Lys Val Ala Glu Val70 75 80GAC GAG ACA GAA ATC AAG CCA TTT GTG GAG AGC TTG TCC AAG TGC CCT 344Asp Glu Thr Glu Ile Lys Pro Phe Val Glu Ser Leu Ser Lys Cys Pro85 90 95AAA CAT GGA CTG CAC AAC CCC TTT AAG TCG CCT GAG AGG TAT CTT CTG 392Lys His Gly Leu His Asn Pro Phe Lys Ser Pro Glu Arg Tyr Leu Leu100 105 110TAT GGG GAC ATA TCT ACA AAG GCA GGA CAC ATG CTT TCC ATA CCA AAG 440Tyr Gly Asp Ile Ser Thr Lys Ala Gly His Met Leu Ser Ile Pro Lys115 120 125GTG TCG GAG TTC TTT GCA AGG CTA ATA CAA AGA GTT GCC CCG AAG AGT 488Val Ser Glu Phe Phe Ala Arg Leu Ile Gln Arg Val Ala Pro Lys Ser130 135 140 145TAC CAC CAG GCT CTT GGT GAA GTT CAA GTC ACC CAG AAG TTT TTT GAG 536Tyr His Gln Ala Leu Gly Glu Val Gln Val Thr Gln Lys Phe Phe Glu150 155 160AAC TTC ACT GGT GAT CAG GTT CGT TTC TTG GCA AGA TCA TTT GGA GTG 584Asn Phe Thr Gly Asp Gln Val Arg Phe Leu Ala Arg Ser Phe Gly Val165 170 175CCG GGA AAC CAT CTT GGT CAG CAA AGT AAT GGC TTC CGA TGG CCT TTT 632Pro Gly Asn His Leu Gly Gln Gln Ser Asn Gly Phe Arg Trp Pro Phe180 185 190GGT CCT GTT GCA ATA ATC ACT CCA TTC AAT TTC CCA CTA GAG ATT CCG 680Gly Pro Val Ala Ile Ile Thr Pro Phe Asn Phe Pro Leu Glu Ile Pro195 200 205GTT CTT CAG TTG ATG GGT GCT TTA TAC ATG GGC AAC AAA CCC CTT CTT 728Val Leu Gln Leu Met Gly Ala Leu Tyr Met Gly Asn Lys Pro Leu Leu210 215 220 225AAA GGT GAT AGC AAG GTGG TCC ATT GGT ATG GAA CAA ATG ATG AGA CTA 776Lys Val Asp Ser Lys Val Ser Ile Val Met Glu Gln Met Met Arg Leu230 235 240CTT CAC TAT TGC GGT TTGG CCT GTG GGA GAT GCT GAC TTT GTC AAC TCG 824Leu His Tyr Cys Gly Leu Pro Val Gly Asp Ala Asp Phe Val Asn Ser245 250 255GAT GGG AAG GCT ATG AAC AAG ATA CTA CTG GAG GCT AAT CCC CGG ATGG 872Asp Gly Lys Ala Met Asn Lye Ile Leu Leu Glu Ala Asn Pro Arg 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Leu370 375 380 385CTT CAG ATA CCG GGA GCT AAG CTG CTC TTT GGC GGC AAG CCT CTG GAG 1256Leu Gln Ile Pro Gly Ala Lys Leu Leu Phe Gly Gly Lys Pro Leu Glu390 395 400AAT CAT ACC ATT CCA TCC ATA TAT GGT GCC GTG AAA CCA ACA GCC GTG 1304Asn His Thr Ile Pro Ser Ile Tyr Gly Ala Val Lys Pro Thr Ala Val405 410 415TAT GTC CCT CTG GAA GAA ATT CTG AAA GTG AGT AAC TAT GAA CTT GTT 1352Tyr Val Pro Leu Glu Glu Ile Leu Lys Val Ser Asn Tyr Glu Leu Val420 425 430ACA AAG GAA ATC TTC GGA CCA TTC CAG GTT GTA ACG GAG TAC AAG AAC 1400Thr Lys Glu Ile Phe Gly Pro Phe Gln Val Val Thr Glu Tyr Lys Asn435 440 445AGT CAA CTT CCT ATG GTT CTG GAA GCT TTG GAG AGG ATG CAC GCA CAT 1448Ser Gln Leu Pro Met Val Leu Glu Ala Leu Glu Arg Met His Ala His450 455 460 465TTA ACA GCT GCT GTA GTT TCG AAC GAT CAG CTG TTT TTG CAG GAA GTC 1496Leu Thr Ala Ala Val Val Ser Asn Asp Gln Leu Phe Leu Gln Glu Val470 475 480ATC GGG AAC ACT GTG AAT GGC ACA ACT TAT GCC GGG TTG CGA GCA AGA 1544Ile Gly Asn Thr Val Asn Gly Thr Thr Tyr Ala Gly Leu Arg Ala Arg485 490 495ACG ACA GGA GCT CCG CAG AAT CAT TGG TTT GGA CCA GCT GGA GAC CCG 1592Thr Thr Gly Ala Pro Gln Asn His Trp Phe Gly Pro Ala Gly Asp Pro500 505 510AGA GGT GCA GGG ATT GGA ACA CCA GAA GCC ATT AAA CTT GTC TGG TCT 1640Arg Gly Ala Gly Ile Gly Thr Pro Glu Ala Ile Lys Leu Val Trp Ser515 520 525TGC CAC CGA GAG ATC ATT TAC GAT ATC GGC CCT GTA TCA CAC CAT TGG 1688Cys His Arg Glu Ile Ile Tyr Asp Ile Gly Pro Val Ser His His Trp530 535 540 545GAA ATT CCT CCA TCC ACT TAGAGAGAGA GTGAGAGATT TGTAAAACTG 1736Glu Ile Pro Pro Ser Thr550TTGAGATGTA GCTGACTGAT CCATGTATCA GAAGTAGGCA TTCATCAGCC CGTGTACCGT1796TACTTTCTAC GAATAAAAAT GCCGGGAAGT CTGTAGATCA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1853(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度551个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑构型线性(ii)分子类型蛋白质Met Tyr Arg Pro Leu Val Ala Arg Leu Leu Arg Asp Ser Val Ala Thr1 5 10 15Arg Lys Gly Ser Ser His Phe Ala Arg Arg Phe Ser His Ser Leu Pro20 25 30Phe Ala Thr Val Asp Ala Glu Glu Leu Ser Gly Ala Lys Pro Ala Glu35 40 45Val Leu Asn Leu Val Gln Gly Asn Trp Gly Gly Ser Ser Ser Trp His50 55 60Thr Val Val Asp Pro Leu Asn Gly Glu Pro Phe Ile Lys Val Ala Glu65 7O 75 6OVal Asp Glu Thr Glu Ile Lys Pro Phe Val Glu Ser Leu Ser Lys Cys85 90 95Pro Lys His Gly Leu His Asn Pro Phe Lys Ser Pro Glu Arg Tyr Leu100 105 110Leu Tyr Gly Asp Ile Ser Thr Lys Ala Gly His Met Leu Ser Ile Pro115 120 125Lys Val Ser Glu Phe Phe Ala Arg Leu Ile Gln Arg Val Ala Pro Lys130 135 140Ser Tyr His Gln Ala Leu Gly G1u Val Gln Val Thr Gln Lys Phe Phe145 150 155 160Glu Asn Phe Thr Gly Asp Gln Val Arg Phe Leu Ala Arg Ser Phe Gly165 170 175Val Pro Gly Asn His Leu Gly Gln Gln Ser Asn Gly Phe Arg Trp Pro180 185 190Phe Gly Pro Val Ala Ile Ile Thr Pro Phe Asn Phe Pro Leu Glu Ile195 200 205Pro Val Leu Gln Leu Met Gly Ala Leu Tyr Met Gly Asn Lys Pro Leu210 215 220Leu Lys Val Asp Ser Lye Val Ser Ile Val Met Glu Gln Met Met Arg225 230 235 240Leu Leu His Tyr Cys Gly Leu Pro Val Gly Asp Ala Asp Phe Val Asn245 250 255Ser Asp Gly Lys Ala Met Asn Lys Ile Leu Leu Glu Ala Asn Pro Arg260 265 270Met Thr Leu Phe Thr Gly Ser Ser Arg Val Ala Glu Lys Leu Ala Leu275 280 285Asp Leu Lys Gly Arg Ile Lys Leu Glu Asp Ala Gly Phe Asp Trp Lys290 295 300Ile Leu Gly Pro Asp Val Asn Glu Ala Asp Tyr Val Ala Trp Va1 Cys305 310 315 320Asp Gln Asp Ala Tyr Ala Cys Ser Gly Gln Lys Cys Ser Ala Gln Ser325 330 335Ile Leu Phe Met His Glu Asn Trp Ala Ala Thr Pro Leu Ile Ser Arg340 345 350Leu Lys Glu Leu Ala Glu Arg Arg Lys Leu Glu Asp Leu Thr Val Gly355 360 365Pro Val Leu Thr Val Thr Thr Glu Ala Met Leu Asp His Leu Asn Lys370 375 380Leu Leu Gln Ile Pro Gly Ala Lys Leu Leu Phe Gly Gly Lys Pro Leu385 390 395 400Glu Asn His Thr Ile Pro Ser Ile Tyr Gly Ala Val Lys Pro Thr Ala405 410 415Val Tyr Val Pro Leu Glu Glu Ile Leu Lys Val Ser Asn Tyr Glu Leu420 425 430Val Thr Lys Glu Ile Phe Gly Pro Phe Gln Val Val Thr Glu Tyr Lys435 440 445Asn Ser Gln Leu Pro Met Val Leu Glu Ala Leu Glu Arg Met His Ala450 455 460His Leu Thr Ala Ala Val Val Ser Asn Asp Gln Leu Phe Leu Gln Glu465 470 475 480Val Ile Gly Asn Thr Val Asn Gly Thr Thr Tyr Ala Gly Leu Arg Ala485 490 495Arg Thr Thr Gly Ala Pro Gln Asn His Trp Phe Gly Pro Ala Gly Asp500 505 510Pro Arg Gly Ala Gly Ile Gly Thr Pro Glu Ala Ile Lys Leu Val Trp515 520 525Ser Cys His Arg Glu Ile Ile Tyr Asp Ile Gly Pro Val Ser His His530 535 540Trp Glu Ile Pro Pro Ser Thr545 550(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度347bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)序列描述SEQ ID NO3ATAAACCTCC TATGACTTAC CGAGCAAATG CGGCTGCGGA ACCACTCGAA TCTACCACTC60TTGCATCAAA ACCACCGCCG TAGCTGCCGA CGTTAAAGTA TCCAGAGATA GCAAGTGACG120AGGCAGTGAA GTTAGTAGAG GAAACAGAAA CTGCAGTAAA ATCATTTCAA ATAACAGAGA180GAGAAGAGTT AGCGGCAAAG AGAAGGAGAC TACCATGGAA ACAAAGCTTG AAAACGAAGG240AAAGAGGAAT CGCAAAAGAA GAGAGCGATC TTAAAGCTGC ATTTGGCCTC CCTTTCGCGG300TGTGTTCACT CTCCCTCTAT CTCTACTTGC GTCTTGTGTT CTCGGCA 347(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度161bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)序列描述SEQ ID NO4ATAAACCTCC ATCACTACCT CTAAAGCTGC ACGGCTGACA CCGCAACACC AAATAACTTG60CCACATTTTC TCTCTATCCA AATCCAAAAT CGACGTCTCT TTCTCCTCCT CATCACTGAG120TTTGTTCATA CTTGCCCAAC CAAAAGCTTG GTACTTTTAG C161(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ii)分子类型DNA(变性寡核苷酸，R＝嘌呤，Y＝嘧啶，I＝肌苷)(iii)序列描述SEQ ID NO5AARGARAT(Y/A)T TYGGICCITT Y 21(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ii)分子类型DNA(变性寡核苷酸，R＝嘌呤，Y＝嘧啶，I＝肌苷)(iii)序列描述SEQ ID NO6AT(Y/A)ACICCIT TYAAYTTYCC I 21(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度24bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ii)分子类型DNA(变性寡核苷酸，R＝嘌呤，Y＝嘧啶，I＝肌苷)(iii)序列描述SEQ ID NO7TGY(A/T)(G/C)IGGIC ARAARTGY(A/T)(G/C) IGCI2权利要求
1.一种分离的核酸分子，其含有能应答于宿主植物和真菌病原体的易感性作用而启动、激活、增强或提高结构基因表达的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的分离的核酸分子，其来源于选自亚麻、玉米、稻、大麦、黑麦和燕麦及其它的一种作物植物。
3.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子为如前文所定义的体内遗传性地连接到SR结构基因上，并与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链至少有40％的一致性。
4.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子为如前文所定义的体内遗传性地连接到SR结构基因上，并与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链至少有60-65％的一致性。
5.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子为如前文所定义的体内遗传性地连接到SR结构基因上，并与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链至少有70-75％的一致性。
6.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子为如前文所定义的体内遗传性地连接到SR结构基因上，并与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链至少有80-90％的一致性。
7.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子为如前文所定义的体内遗传性地连接到SR结构基因上，并能在至少低严紧性条件下与SEQID NO1所示核苷酸序列或其互补链杂交。
8.根据权利要求7的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因还含有与SEQID NO1所示核苷酸序列或其互补链至少有40％的一致性的核苷酸序列。
9.根据权利要求7的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因还含有与SEQID NO1所示核苷酸序列或其互补链至少有60-65％的一致性的核苷酸序列。
10.根据权利要求7的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因还含有与SEQID NO1所示核苷酸序列或其互补链至少有70-75％的一致性的核苷酸序列。
11.根据权利要求7的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因还含有与SEQID NO1所示核苷酸序列或其互补链至少有80-90％的一致性的核苷酸序列。
12.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子含有长度至少为2kb，在5′末端含有SEQ ID NO3所示的序列或其同源序列、类似物或衍生物，在3′末端含有SEQ ID NO4所示的序列或其同源序列、类似物或衍生物的核苷酸序列。
13.根据权利要求12的分离的核酸分子，其还能在至少低严紧性条件下与保藏在AGAL保藏号为N96/027087的微生物中所含有的亚麻Fis1基因启动子杂交。
14.根据权利要求13的分离的核酸分子，其中所述核酸分子为植物来源的。
15.根据权利要求14的分离的核酸分子，其中植物为选自亚麻、玉米、稻、大麦、黑麦和燕麦及其它的一种作物植物。
16.一种分离的核酸分子，其含有如前文所定义的SR结构基因。
17.根据权利要求16的分离的核酸分子，其中所述核酸分子来源于选自亚麻、玉米、稻、大麦、黑麦和燕麦及其它的一种作物植物。
18.根据权利要求16的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因与SEQ IDNO1所示核苷酸序列或其同源序列、类似物或衍生物至少有40％的一致性。
19.根据权利要求16的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因与SEQ IDNO1所示核苷酸序列或其互补链至少有60-65％的一致性。
20.根据权利要求16的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因与SEQ IDNO1所示核苷酸序列或其互补链至少有70-75％的一致性。
21.根据权利要求16的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因与SEQ IDNO1所示核苷酸序列或其互补链至少有80-90％的一致性。
22.根据权利要求16的分离的核酸分子，其中所述核酸分子能在至少低严紧性条件下与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互补链杂交。
23.一种分离的核酸分子，其含有编码或互补于如前文所定义的SR基因产物编码序列的核苷酸序列。
24.根据权利要求23的分离的核酸分子，其中所述SR结构基因产物含有与SEQ ID NO2所示多肽至少有40％的一致性的氨基酸序列。
25.根据权利要求24的分离的核酸分子，其来源于选自亚麻、玉米、稻、大麦、黑麦和燕麦及其它的一种作物植物。
26.根据权利要求25的分离的核酸分子，其中如果所述核酸分子来源于玉米，其编码Mis1多肽。
27.根据权利要求25的分离的核酸分子，其中如果所述核酸分子来源于亚麻，其编码的是Fis1多肽。
28.一种分离的核酸分子，其能在至少低严紧性条件下与保藏在AGAL保藏号为N96/027087的微生物中所含有的亚麻Fis1启动子序列杂交。
29.一种分离的核酸引物分子，其含有来自SEQ ID NO1、3、4、5、6或7中任一所示的亚麻Fis1序列的至少10个连续核苷酸。
30.一种含有根据权利要求1到15任何一项的核酸分子的遗传结构。
31.根据权利要求30的遗传结构，其中所述核酸分子适当地连接到一结构基因上。
32.根据权利要求31的遗传结构，其中所述结构基因为报告基因。
33.根据权利要求32的遗传结构，其中所述报告基因选自GUS、氯霉素乙酰转移酶基因和萤火虫荧光素酶基因。
34.一种保藏于AGAL保藏号为N96/027087的遗传结构。
35.根据权利要求31的遗传结构，其中所述结构基因含有与SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其同源序列、类似物或衍生物至少有40％的一致性的核苷酸序列。
36.根据权利要求31的遗传结构，其中所述结构基因为细胞毒素基因。
37.根据权利要求36的遗传结构，其中所述细胞毒素基因为芽孢杆菌RNA酶或其它核酶基因。
38.根据权利要求30的遗传结构，其中所述核酸分子适当地与能抑制植物细胞生存所需的植物基因表达的核酶、反义或共抑制分子连接。
39.一种用根据权利要求30的遗传结构转化的转基因植物。
40.一种用根据权利要求31的遗传结构转化的转基因植物。
41.一种用根据权利要求32的遗传结构转化的转基因植物。
42.一种用根据权利要求33的遗传结构转化的转基因植物。
43.一种用根据权利要求34的遗传结构转化的转基因植物。
44.一种用根据权利要求35的遗传结构转化的转基因植物。
45.一种用根据权利要求36的遗传结构转化的转基因植物。
46.一种用根据权利要求37的遗传结构转化的转基因植物。
47.一种用根据权利要求38的遗传结构转化的转基因植物。
48.一种含有根据权利要求16到27任何一项的核酸分子的遗传结构。
49.一种重组SR基因产物，其含有与SEQ ID NO2至少有40％一致性的氨基酸序列。
50.根据权利要求49的重组SR基因产物，其还含有至少一种选自如上文表2中所定义的GPL、GSG、GQG和EEP的氨基酸序列基元。
51.一种分离的抗体分子，其能结合权利要求49或50的重组SR基因产物。
52.一种对易感性作用中真菌病原体的传播抗性提高的植物的生产方法，所述方法包括用根据权利要求36到38任何一项的遗传结构转化植物细胞并从中再生整个植物的步骤。
53.根据权利要求52的方法，其中所述植物和相应的真菌病原体选自下列病原体宿主植物组合病原体宿主植物禾柄锈菌 小麦，大麦和黑麦条形柄锈菌小麦和黑麦隐匿柄锈菌小麦和黑麦大麦柄锈菌大麦禾冠柄锈菌燕麦高粱柄锈菌玉米多堆柄锈菌玉米紫色柄锈菌高粱Puccinia sachari锈菌 甘蔗屈恩氏锈菌甘蔗落花生柄锈菌 花生Puccinia stachmanii锈菌 棉花Uromyces striatus medicaginis条纹单胞锈菌 苜蓿菜豆单胞锈菌 phaseolus豆Hemileia vastatrix咖啡锈菌亚麻栅锈菌亚麻Gymnosporangium juniperi-virginianae桧胶锈菌 雪松和苹果Cronartium ribicola锈菌 白松Cronartium fusiforme锈菌 火炬松和沼泽地松
54.根据权利要求53的方法，其中所述植物选自亚麻、玉米、稻、小麦、大麦、黑麦和燕麦。
55.一种检测植物中可与之形成易感性作用的真菌病原体的感染的方法，所述方法包括检测所述植物中SR结构基因表达上升的步骤。
56.根据权利要求55的方法，其中所述的检测表达提高的步骤通过用含有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或从其中衍生的长度至少为10个连续核苷酸的第二核酸分子在一定条件下与来自所述植物的核酸分子接触一段足以形成双链核酸分子的时间来进行。
57.根据权利要求56的方法，其中所述的第二核酸分子用报告分子标记。
58.根据权利要求57的方法，其还包括检测结合的报告分子的量的步骤。
59.根据权利要求55的方法，当用于检测植物中真菌病原体感染时，其中所述植物和相应的真菌病原体选自下列病原体宿主植物组合病原体 宿主植物禾柄锈菌 小麦，大麦和黑麦条形柄锈菌小麦和黑麦隐匿柄锈菌小麦和黑麦大麦柄锈菌大麦禾冠柄锈菌燕麦高粱柄锈菌玉米多堆柄锈菌玉米紫色柄锈菌高粱Puccinia sachari锈菌 甘蔗屈恩氏锈菌甘蔗落花生柄锈菌 花生Puccinia stachmanii锈菌 棉花Uromyces striatus medicaginis条纹单胞锈菌 苜蓿菜豆单胞锈菌 phaseolus豆Hemileia vastatrix咖啡锈菌亚麻栅锈菌亚麻Gymnosporangium juniperi-virginianae桧胶锈菌 雪松和苹果Cronartium ribicola锈菌 白松Cronartium fusiforme锈菌 火炬松和沼泽地松
60.根据权利要求59的方法，其中所述植物选自亚麻、玉米、稻、小麦、大麦、黑麦和燕麦。
61.来自根据权利要求27到33任何一项的转基因植物的子代植物。
全文摘要
本发明主要涉及可用于植物真菌感染诊断和治疗的遗传序列,该感染涉及一真菌病原体与宿主植物间的易感性作用。尤其是,本发明提供了一种应答于一真菌病原体在易感性作用中对植物的感染而启动、激活或增强所述植物中一基因表达的遗传序列。本发明进一步提供了诸如结构基因的遗传序列,该基因的表达可在对植物与真菌病原体间易感性作用的应答中被诱导。本发明进一步提供了对一真菌病原体在易感性相互作用中所引起感染的检测方法,和产生对所述真菌病原体抗性提高的转基因植物的方法。可表达一真菌病原体人造抗性基因的转基因植物材料也在本发明范围之内。
文档编号A01H5/00GK1187850SQ96194700
公开日1998年7月15日 申请日期1996年5月3日 优先权日1996年5月3日
发明者A·J·普赖尔, J·K·罗伯茨 申请人:联邦科学和工业研究组织, 澳大利亚国立大学