一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物分子检测领域，尤其设及一种军团菌快速检测与分型试剂盒及 其检测方法。
【背景技术】
[0002] 军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在±壤和水系统中广泛存在。目前军团 菌属有52种包括70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离。近年来发现，约有一半 的军团菌种与人类疾病有关，其中80%W上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。军团菌通 过空气W气溶胶的形式感染人，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，建立一种 能检测军团菌和快速鉴别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的方法具有重要的临床意义。
[0003] 目前对军团菌的检测鉴定方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌 分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和价格昂 贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴定工作 提供了较简便和准确的方法。PCR方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是通过检测军 团菌中的特异基因，W达到快速检测军团菌的目的。
[0004] 中国专利CN102071247B公开了一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂 盒，所述的试剂盒组分包括核酸提取液、PCR缓冲液、巧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性 对照，其检测的原理是采用特异性祀序列并根据此设计引物探针并通过巧光PCR扩增，W 不同巧光标志的探针实时检测同一祀序列而检测军团菌，并区分非嗜肺与嗜肺军团菌。该 检测试剂盒操作简便，可W避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性，而且能解决因样本 中PCR抑制剂引起的假阴性的问题。但是，该检测试剂盒对样品要求高，而且检测结果判断 复杂，检测结果准确性较低，不利于该试剂盒的推广和应用。
[0005] 中国专利CN101597647B公开了 一种军团菌快速检测试剂盒及其检测方法，所述 试剂盒包括细菌组DNA提取液、PCR反应液、PCR产物纯化液和酶切反应液。该试剂盒的是 通过应用第一PCR反应液扩增后，W前一步PCR反应产物为模板，用第二PCR反应液扩增， 将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；将第一PCR纯化液与最终PCR产物混合后加 入到PCR纯化柱内，离屯、后加入第二PCR纯化液，再次离屯、后，加入第SPCR纯化液后离屯、， 得到PCR纯化产物；将PCR纯化产物加入到酶切反应液中消化，将酶切产物做琼脂糖凝胶电 泳检测。该试剂盒具有灵敏度高和特异性高的优点。但是，该试剂盒检测步骤较多，操作繁 琐，大大的限制了该试剂盒的应用。
[0006] 因此，研究和开发出一种操作简单、检测结果便于判断、检测结果准确性高的军团 菌试剂盒是当前亟需解决的难题。
【发明内容】
[0007] 为解决现有技术中军团菌试剂盒存在操作繁琐、结果判断复杂和检测结果准确性 低的缺陷，本发明提供一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法，W解决上述问题。
[0008] 本发明提供一种军团菌快速检测与分型试剂盒，包括细菌基因组DM提取液、PCR 反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液，所述PCR引物混合液、阳性对照液和 阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异 引物，所述军团菌属特异引物为：
所述嗜肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物为：
[0009] 进一步地，所述军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位 点特异引物的祀基因均为16srRNA基因。
[0010] 进一步地，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：化elex100resin5〇/〇; Tris-肥1 10ml,P册.3;乙二胺四乙酸二钢0.1ml;叠氮钢0.1 %;蛋白酶K200yg/ml。
[0011] 进一步地，所述PCR反应液为2XPCR反应液，所述2XPCR反应液的组分及其组 分浓度为：〇. 1U/WEas^aqDNA聚合酶；500 剛dNTP;20mlhis-肥 1，P册.3 ;100ml KCl; 3mlMgCl2。
[001引进一步地，所述PCR引物混合液中军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16srRNA基因 单核巧酸多态性位点特异引物的浓度比为1-3 :1-3,所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌 16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物的浓度比优选为2 :1。
[001引进一步地，所述阳性对照液还含有嗜肺军团菌基因组DNA，所述军团菌基因组DNA核巧酸序列在NCBI基因库上编号为NR_074231。
[0014]另外，本发明还提供了一种军团菌快速检测与分型的检测方法，包括如下步骤： Sl应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA; S2W细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌 16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物进行PCR扩增； S3将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增； S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0015] 优选地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段1 :94°CSmin;阶段2 : 94°C20s;阶段3:59°C20s;阶段4:72°C25s;35个循环；阶段5:72°C5min;在4°C保溫。
[0016] 优选地，所述步骤S2中军团菌属特异引物扩增序列为26化p。其中， 化261F-GL261R引物对扩增序列为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列，具体序列如下：
[0017] 优选地，所述步骤S2中肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物分 别与军团菌属特异引物配对扩增26化P内的一段序列；化261F- (LPA628R)引物对扩增片 段为203bp; (LP-C6叩)-GL261R引物对扩增序列为97bp。其中，GL261F- (LP-A628R)引物对 扩增片段亦为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列为上述26化P片段内的一段203bp序 列，具体序列如下：
(LP-C629F)-GL261R引物对扩增序列亦为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列为上述 261BP片段内的一段97bp序列，具体序列如下：
[0018] 本发明提供的军团菌快速检测与分型试剂盒是利用等位基因特异性PCR原理，利 用等位基因上一两个碱基的差异，特异扩增其中一个等位基因的技术。其主要原理是利用 一对特异与其中一条等位基因完全互补的引物，而与另外一条等位基因在3'端不互补的引 物进行基因扩增，从而达到鉴别的效果。发明人经过生物信息学方法的研究发现军团菌属 16srRNA基因里有一段保守序列中存在两个单核甘酸多态性位点（SNP)，该位点在嗜肺军 团菌中为A62SC629,而在非嗜肺军团菌中的单核甘酸多态性位点（SNP)贝怀是A62SC629,因此利 用一对军团菌属特异引物和一对肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物做 多重PCR可W快速检测军团菌属，同时还可W鉴别出军团菌是嗜肺军团菌还是非嗜肺军团 -tt： 园O
[0019] 本发明提供的军团菌快速检测与分型试剂盒结果判定方法是：对PCR产物的琼 脂糖凝胶电泳结果进行分析，若出现261bp条带，则说明检测标本中含有军团菌属细菌，反 么则说明检测标本中不含军团菌属细菌；若除了出现26化P条带外还同时出现了 203bp和 97bp条带，则说明检出的军团菌为嗜肺军团菌，若除了 261bp条带，没有同时出现203bp和 97bp条带，则说明检测到的军团菌为非嗜肺军团菌。
[0020] 本发明提供军团菌快速检测与分型试剂盒不仅能在临床中应用，还可W应用于环 境水标本中，为环境水源风险性控制及军团菌感染流行病学调查提供依据和工具，有利于 该检测试剂盒的推广和应用。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的军团菌快速检测与分型试 剂盒具有特异性好和准确性高的优点，提高了检测效率。此外，本发明还提供军团菌快速检 测与分型的检测方法，通过使用本发明提供的特异性的引物，可W快速、简便的检测出军团 菌，同时还可W进一步分型为嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌，该检测方法无需进行多次凝胶 电泳分析，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的军团菌快速检测与分型的试剂盒。
【附图说明】
[0022] 图1为PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中：Marker条带；从下到上分别为：100bp、 200bp、300bp、400bp、500bp和600bp，1-4分别为各个不同的菌种鉴定结果，PC为阳性对 照，NC为阴性对照。
【具体实施方式】
[0023] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。其中，化elex100resin购买自bio-rad公司（货号：1432832)。
[0024] 实施例1、引物 本发明提供一种军团菌快速检测与分型的引物。
[0025] 表1本发明提供的引物
实施例2、引物的配对及其扩增片段大小 本发明提供的肺军团菌16srRNA