一种rs12979860检测引物、其组合物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及指导丙型肝炎用药的基因检测技术领域，尤其设及一种rsl2979860 检测引物、其组合物及方法。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎是一种主要经由血液传播的疾病，目前世界上约有3. 4亿人患有慢性丙 型肝炎病毒（HCV)感染。我国约有4千万感染者，每年新发病例400万例左右，仅有不到 30%的HCV感染者可在半年内自发清除病毒，多数的HCV感染者将发展为慢性感染，其中约 有30 %的患者会发展为肝脏纤维化和肝细胞癌等。丙型肝炎目前治疗采用的药物主要有干 扰素（PEG-IFNal地a)联合利己韦林（ribavirin，RBV)、特拉匹韦（telaprevir，TVR)和波 西普韦化OC巧revir，B0C)等。现已有研究证明，PEG-IFNalpha与RBV联合应用获得持续 病毒应答（SVR)和HCV自发清除的可能性，均与19号染色体上的IL28B基因密切相关，经 过GWAS分析发现，IL28B的一个SNP-------rsl2979860与HCV1型感染者获得SVR强烈 相关。rsl2979860是已知的与HCV感染者的SVR情况最相关的基因位点，其中C/C基因型 与SVR正关联，而另外两种基因型（C/T和T/T)与非病毒学应答（NVR)正关联。C/C基因型 的患者SVR获得率较其他两种基因型患者高出一倍，而且IL28B的检测对SVR的预测要优 于治疗前检测HCVRNA水平，纤维化分级W及年龄和性别，且对于HCV1型的效果要好于2 型和3型。鉴于IL28B基因多态性的临床价值，2011年欧洲肝脏研究学会在HCV感染诊治 指南中就新加入了对宿主IL28B基因型的检测W预测抗病毒治疗疗效，同年9月美国肝病 研究会更新的《基因1型慢性HCV感染治疗指南》中也强调，对于标准治疗联合TVR的S联 疗法，IL28B基因型是预测患者获得SVR的强有力因素，在治疗前应考虑对患者进行IL28B 基因型检测，中国国家食品药品监督管理总局（C抑A)于2015年发布的《药物代谢酶和药物 作用祀点基因检测技术指南（试行）》中明确指出，"检测IFNL3rsl2979860基因型有助于 HCV感染的个体化治疗，从而提高其治疗水平"。
[0003] 目前针对rS12979860的检测手段很多，主要包括直接测序法，PCR-SSCP法， 化qmanSNP法，等位基因特异性PCR法，单碱基延伸法等。直接测序法可检测所有突变，然 而劳动量大，不够灵敏，并且需要非常昂贵的DNA分析仪，因此并不适合推广应用；Taqman SNP法，单碱基延伸法，HRM法等虽然灵敏度很高，但同样也需要依赖较为昂贵的进口设备， 因此大范围的推广也比较困难。PCR-SSCP法和等位基因特异性PCR法在样本量较大时操作 很繁琐，并且由于都要做开管检测，所W很容易造成气溶胶污染而出现假阳性。
[0004] 环介导等溫扩增（Loop-mediatedIsothermalAmplification,LAMP)技术是日本 科学家于2000年开发出来的一种恒溫扩增技术，针对祀基因的六个区域设计四条特异性 引物，在链置换DNA聚合酶的作用下恒溫扩增，可在十几分钟到一小时之内产生IO9-IQin数 量级的产物，反应结束后通过肉眼直接观察体系状态的改变来判定待测样本的基因型，无 需开管，因此大大简化了操作步骤，同时又可W有效避免样本交叉污染，而且，仅需普通水 浴锅即可开展检测，又节约了大量的检测成本。因此，用LAMP法检测rsl2979860对于丙型 肝炎患者的基因型检测、丙型肝炎的治疗等具有重要的意义。
【发明内容】
阳0化]本发明要解决的问题是现有的检测rsl2979860的方法较为复杂，成本高、工作量 大，不适宜大范围推广使用。
[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种适于等位基因特异性LAMP对rs12979860的基 因型进行检测的引物。所述rsl2979860检测引物，包括W下引物：
[0012] 本发明提供的用于rsl2979860检测的上述的引物中，在3'端的倒数第第=位人 为引进了一个突变，可进一步降低非特异扩增的可能性，提高检测的准确性。
[0013] 本发明的第二个目的在于提供一种rs12979860检测组合物。所述rs12979860检 测组合物，包括上述的引物，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
[0014] 进一步地，所述组合物分为两个体系，分别记为体系C和体系T。体系C用于检测 C等位基因，包括F3、B3、FIP、BIPC、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。体系T用于检测T 等位基因，包括F3、B3、FIP、BIPT、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
[0015] 进一步地，两个体系中均还包括用于显示体系颜色的指示剂。
[0016] 优选地，所述指示剂为巧黄绿素和氯化儘的组合物或者为径基糞酪蓝。
[0017] 优选地，所述两个体系中：F3的浓度相同，为0. 4yM;B3的浓度相同，为0. 4yM; FIP的浓度相同，为1. 6yM;体系C中BIPC的浓度和体系T中BIPT的浓度相同，均为 1. 6yM。
[0018] 进一步地，所述两个体系中缓冲液的浓度相同。缓冲液包括如下浓度的组分： Tris-肥 1 20mM，KCl50mM，（NH4)2S〇4l〇mM，M拆〇44mM，Tween-200. 1% (体积分数）。
[0019] 优选地，两个体系中指示剂的浓度相同。若指示剂为巧黄绿素和氯化儘的组合 物，巧黄绿素的浓度为25yM，氯化儘的浓度为0. 5mM。若指示剂为径基糞酪蓝，其浓度为 120yM。
[0020] 优选地，两个体系中dNTP的浓度相同，均为1. 4mM。
[0021] 优选地，两个体系中Bst聚合酶均为8U。
[0022] 本发明的第=个目的在于提供一种用等位基因特异性LAMP对rsl2979860的基因 型进行检测的方法。所述rsl2979860的检测方法，使用上述的rsl2979860检测组合物，具 体为：将待检测的核酸分别加入到体系C和体系T中，得到的混合物于60~70°C下反应， 反应结束后观察体系的变化。
[0023] 进一步地，所述待检测的核酸在两个体系中的浓度一致，均为0. 8~4ng/yL。
[0024] 优选地，反应结束后，将两个体系分别进行灭活处理。灭活处理使得体系中的酶失 活，防止体系放置时间长时发生非特异性扩增。 阳0巧]优选地，反应溫度为68 °C。
[0026] 优选地，所述反应时间为40~120min。
[0027] 在本发明的反应体系中，反应前体系为澄清状态，发生阳性反应时，儀离子与副产 物焦憐酸形成沉淀，体系产生肉眼可见的沉淀，变为浑浊状态。观察体系状态的变化可W直 接判定是否发生扩增反应。当体系中存在指示剂时：（1)若指示剂为径基糞酪蓝，反应前体 系中的儀离子与dNTP馨合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，儀离子与副产物焦憐酸 形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色；(2)若指示剂为巧黄绿素和 氯化儘的组合物时，反应前巧黄绿素与氯化儘中的儘离子结合，体系呈现黄色；当有阳性反 应时，副产物焦憐酸与儘离子结合生成沉淀，巧黄绿素与体系中的儀离子结合，颜色逐渐由 黄色变为巧光绿色。观察反应体系颜色和/或状态的变化可W直接判定是否发生扩增反 应。
[0028] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0029] 1.本发明在LAMP基础上采用等位基因特异性LAMP方法，针对等位基因之间的碱 基差异设计特异引物，从而检测某一特异等位基因。具有灵敏度高，与化qman相同的敏感 性，特异性好且操作简便的优点。
[0030] 2.本发明提供的rsl2979860检测引物中，在3'端的倒数第=位人为引进了一个 突变，可进一步降低非特异扩增的可能性，提高检测的准确性。
[0031] 3.本发明中，使用等位基因特异性LAMP方法，反应中有大量的DNA合成，从dNTP 中析出的焦憐酸根与反应体系中的儀离子沉淀，形成大量的焦憐酸儀沉淀，呈现肉眼可见 的浑浊状态。可通过观察反应体系状态的变化判定反应是否发生。进一步地，本发明在反 应体系中加入指示体系颜色变化的指示剂，通过反应体系颜色的变化进行判断，避免沉淀 偶尔不是非常明显使得肉眼不易判定。
[0032] 4.本发明提供的检测方法，整个检测所需要的设备仅是水浴锅或金属浴或者热 循环仪，检测成本低；检测耗时一小时左右，时间较短；且本检测方法不需要额外的开管检 ，因此有效避免了交叉污染的产生，提高了检测的准确性。本发明提供的检测方法成本