反应液以25 y L计，含有12. 5 y L 2X等温反应缓冲液、1. 0 y L Bst DNA聚合酶、 40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物 L、1. 0 y L钙黄绿素、待检细菌基因组DNA若干、余量为灭菌双蒸水；
[0044] 其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/ y L ;
[0045] 2X 等温反应缓冲液中含有 40mM pH 为 8.8 的 Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgS04、 20mM(NH4)2S04、0. 2wt% Tween20、l. 6M 甜菜碱、2. 8mM dNTP〇
[0046] 其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8,外引物与环引物的摩尔比为1:4。
[0047] 为了设置对照组，每个试剂盒中最少设置3个LAMP反应管，此试剂盒设置6个 LAMP反应管。
[0048] 扩增产物的副产物焦磷酸离子与Mg2+反应会产生焦磷酸镁（白色沉淀）的衍生 物，此衍生物与生成的扩增产物成正比，由于LAMP法能产生大量的扩增产物，衍生物产量 也会大增，于是可以呈现出肉眼可见的白色沉淀，可验证是否有靶基因的存在。为了更加直 观的判断结果，在反应液中还加入钙黄绿素（锰离子螯合型），与试剂中的锰离子（Mn 2+)结 合处于淬灭状态，焦磷酸离子与Mn2+结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。 因此便于根据扩增产物颜色变化来判断扩增结果。
[0049] 实施例2 :用环介导等温扩增方法检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基 化酶rmtB的检测方法
[0050] (1)提取待检临床菌株的基因组DNA
[0051] 将待检的临床菌株过夜培养后，取lmL的菌液12000rpm离心2min，彻底弃上清，取 沉淀加入lmL无菌双蒸水，沸水浴lOmin，12000rpm离心2min，取上清至新离心管中，测定并 调整DNA浓度为500ng/ y L，-20°C保存备用。
[0052] (2) LAMP 扩增
[0053] 使用实施例1中的试剂盒，设置一个检测管、一个阳性对照管和一个阴性对照管。 在检测管内加入2 y L待检DNA样本，阳性对照管中加入2 y L含rmtB基因的大肠杆菌基因 组DNA(DNA浓度为100ng/ y L)，阴性对照管中加入2 y L灭菌双蒸水。加完后混匀，稍离心， 使沾在管壁上的样品也溶解在反应液中。将反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63°C 水浴恒温反应45-60min。
[0054] (3)结果分析：
[0055] ①观察反应后的混合液颜色，阳性对照管变为绿色，阴性对照管中为橙色，检测管 中为绿色，说明待检细菌中含有rmtB基因，如图1所示。
[0056] 实施例3 :rmtB基因LAMP检测方法与普通PCR方法检测灵敏度比较
[0057] 取含rmtB基因的大肠杆菌基因组DNA (浓度为500ng/ y L)，按10倍比稀释，分别 为原液的 KT1，1(T2,1(T3,1(T4,1(T 5,1(T6,1(T7,1(T8倍，分别取 1 U L 作为 LAMP 反应和 PCR 反应 的模板。在LAMP反应管和PCR反应管中分别加入以上倍比稀释的含rmtB基因的细菌基因 组 DNA lyL。
[0058] 其中LAMP反应管置于63°C恒温水浴锅中反应45-60min，反应结束后直接用肉眼 观察颜色变化。
[0059] PCR反应中所用引物为根据NCBI上已知的rmtB基因保守序列用Primer5. 0软件 设计，按以下碱基序列经DNA合成仪合成：
[0060] 上游引物为 up :5' -ATATGTCACCCCGGAATCGC-3'（SEQ No. 6)，
[0061] 下游引物为 down :5' -CATCCTGCAGGGCAAAGGTA-3'（SEQ No. 7) 〇
[0062] 扩增目的片段大小为308bp。PCR反应体系设置为：总体积25yL，其中10XPCR缓 冲液2.5 1^、（1阶130.5 1^、10 1^上游引物即0.5 1^、10 1^下游引物(1〇￥110.5 1^、丁&1 DNA聚合酶0. 25yL、模板lyL、灭菌双蒸水补齐25yL。PCR产应条件为：95°C 2min，然后 进行30个循环，循环条件为94°C 30s，58 °C 30s，72°C 30s，最后72°C延伸2min。反应结束 后取8 y L PCR产物进行1. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据是否扩增目的条带判定阳性和 阴性。
[0063] LAMP结果如图2所示。加入钙黄绿素的反应管内的液体颜色，1~8管内颜色均 为明显的绿色，9管内颜色为橙色。说明原液稀释KT 7(5*l(T5ng/yL)还可以检测到rmtB基 因。
[0064] PCR产物经电泳检测结果如图3所示。反应管1~6均出现目的条带，且条带越来 越淡，而7~9未出现目的条带。说明原液稀释1(T 5可以检测到rmtB基因。
[0065] 综合LAMP和PCR反应结果可以得出，LAMP反应灵敏度比PCR反应要高2个数量 级（100倍），反应时间比PCR短，且不需要用凝胶电泳检测，直接通过肉眼观察即可判定结 果。
[0066] 实施例4 :rmtB基因LAMP检测方法和普通PCR方法特异性比较
[0067] 选择大肠杆菌（ATCC 25922)，沙门氏菌（ATCC 50035)，金黄色葡萄球菌（ATCC 29213)，金黄色葡萄球菌（ATCC 25923)，铜绿假单胞菌（ATCC 27853)和肺炎双球菌（ATCC 49619)作为试验菌株，分别提取基因组DNA，按照实施例2中所建立的rmtB基因环介导等 温扩增检测方法进行检测；同时以以上基因组DNA为模板按照实施例3的PCR反应体系和 检测程序进行PCR扩增；都以大肠杆菌（含rmtB基因）基因组DNA作为阳性对照，灭菌双 蒸水作为阴性对照，验证本发明所建立的LAMP方法的特异性。
[0068] LAMP结果只有阳性对照管变为绿色，如图4所示，PCR结果显示有2例出现假阳 性，说明本发明所建立的LAMP方法检测rmtB基因比PCR方法特异性好。由于LAMP方法更 加直观简便，且耗时短，因此更加适合临床快速检测的需要。
【主权项】
1. 一种16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物，其特征是，由一对外引物F3、B3, 一 对内引物FIP、BIP和一个环引物L组成，其核苷酸序列分别如下： 外引物F3 :5' -CGATGCCCTCACCTCCAT-3' ； 外引物 B3 :5' -GCCmTTTACATCGCCCG-3'； 内引物FIP:5' -AITCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3'； 内引物BIP:5' -CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3'； 环引物L:5' -GCTGCATGGAAITTGCGGGG-3'。
2. -种含有权利要求1所述引物的16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒。
3. 如权利要求2所述的16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述 外引物与内引物的摩尔比为1:8,外引物与环引物的摩尔比为1:4。
4. 如权利要求2所述的16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，它包 括若干个装有反应液的LAMP反应管，其中，每25yL反应液中含有：12. 5yL2X等温反应 缓冲液、l.OuLBstDNA聚合酶、40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、 5pmol外引物B3、20pmol环引物L、待检细菌基因组DNA若干，余量为灭菌双蒸水。
5. 如权利要求4所述的16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是， 所述2X等温反应缓冲液中含有40mMpH为8.8的Tris-HCl、20mMKCl、16mMMgS04、 20mM(NH4)2S04、0. 2wt%Tween20、l. 6M甜菜碱、2. 8mMdNTP〇
6. 如权利要求5所述的16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述 BstDNA聚合酶的活性单位为8U/yL。
7. 如权利要求5或6所述的16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是， 所述25yL反应液中还含有IyL的钙黄绿素。
8. -种16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是， (1) 提取待检细菌基因组的DNA; (2) 使用权利要求6所述的LAMP检测试剂盒进行检测：将待检细菌基因组DNA加入 LAMP反应管的反应液内，混勾，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为 含有rmtB基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置 水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63°C水浴恒温反应45-60min; (3) 结果判断：反应结束后，凭借肉眼可见的白色沉淀判定结果，有白色沉淀为阳性， 清亮为阴性。
9. 一种16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是， (1) 提取待检细菌基因组的DNA; (2) 使用权利要求7所述的LAMP检测试剂盒进行检测：将待检细菌基因组DNA加入 LAMP反应管的反应液内，混勾，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为 含有rmtB基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置 水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63°C水浴恒温反应45-60min; (3) 结果判断：反应结束后，凭借反应液的颜色判定结果，绿色的为阳性，仍保持橙色 的为阴性。
10. 如权利要求8或9所述的16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是， 所述步骤（1)提取待检细菌基因组DNA包括以下步骤：将待检的细菌菌株过夜培养后，取
【专利摘要】本发明公开了一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法。本发明的检测引物由一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个环引物L组成。检测试剂盒包括若干个装有反应液的LAMP反应管，反应液中含有2×等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、引物等。检测方法为：首先提取待检细菌基因组的DNA，加入LAMP反应管的反应液内，63℃水浴恒温反应45-60min，根据有无白色沉淀或者反应液加入钙黄绿素后是否变绿判定结果。本发明解决了现有PCR技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷；具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作简单，适于现场快速检测的优点。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104789659
【申请号】CN201510147249
【发明人】刘玉庆, 齐静, 杨炜华, 黄保华, 骆延波, 胡明, 李璐璐, 张庆
【申请人】山东省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月31日