意；图中第一、屯行的数字表示测序反应的步骤， 第二、六行括号内的字母表示测序反应的加入的核巧酸的简写（"G"代表dGTP，"CA"代表 "dCTP+dATPaS"，其余类推），括号上方的数字表示测序反应合成的核巧酸数目，第=、五行 表示100%甲基化值NA序列1)和100%未甲基化值NA序列2)序列；
[0027] 图2对人样本RARP2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点按照特定两核巧酸、 dGTP加入方式（见表1)进行焦测序得图谱。
【具体实施方式】
[0028] 本发明提供的一种新型焦测序定量检测甲基化的方法，利用两核巧酸同时加入到 反应中的快速通过DNA模板序列中"A"、"G"、"T"区域，而应用单个核巧酸的测序反应测定 DNA模板序列中"C"含量。然后，根据单个核巧酸的测序反应测定DNA模板序列中"C"含 量，即可确定甲基化程度。
[0029] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 阳030] 实施例1 :
[0031] 人样本RARP2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点分析方法，具体方法包括：
[0032] (1)将血样本采用传统的蛋白激酶K与苯酪/氯仿抽提法提取外周血中的基因组 DNA；
[0033] (2)亚硫酸氨钢修饰基因组DNA :按照CpGenome I'urbo Bisulfite Modification Kit (Millipore公司）提供的操作流程对基因组DM进行亚硫酸氨钢处理，并纯化、回收修 饰后DNA ;
[0034] (3)PCR扩增：PCR引物：5' -biotin-GTTGTTTGAGGATTGGGATG-3,， 5 ' -ATACCCAAACAAACCCTACTC-3 '与200mg经亚硫酸氨钢处理处理的基因组DNA，0. 2mM dNTP，IUTaqDNA聚合酶，1X扩增缓冲液，1.8mMMgClz的50yLPCR扩增体系进行0增， 扩增条件为：95°(：起始变性5111111;40个热循环为：94°(：变性3〇3、54°(：退火453、72°(：延伸 45s;最后 72°C延伸 7min;
[0035] (4)PCR扩增产物与链霉亲和素修饰的磁珠反应，使修饰生物素的DNA链固定 到磁珠上，在0.IM化OH溶液下变性，将未固定的另一条DNA链清除；然后用洗液（IOmM Tris-Acetate,pH7.6)洗涂，得到固定的单链DNA模板；
[0036] (5)将测序引物5' -CCCAAACAAACCCTACT-3'与磁珠固定的其中一份单链DNA模 板模板在反应体系（（IOmMhis-肥1，2M化Cl,ImM邸TA(乙二胺四乙酸钢），0. 1%Tween 20,pH7.6) 80°C下杂交5min，然后自然冷却至室溫，完成杂交；
[0037] (6)焦测序反应体系包括0.IMTris-Ac(抑7. 7)，2mM邸TA(乙二胺四乙酸 钢），10mMMg(Ac)2,〇. 2%BSA(小牛血清蛋白），10mMDTT(二琉苏糖醇），10mMAPS(憐 酷硫酸腺），0. 4mg/mLPVP(聚乙締化咯烧酬），4mMD-Iuciferin(虫巧光素），2U/mLATP sulfuiylase(S憐酸腺巧硫酸化酶），0. 4mMIuciferase(巧光素酶），2U/mLapyrase VII(S憐酸腺巧双憐酸酶VII)，2U/mLDNA聚合酶I(Klenowfragment,exo-);焦测序反 应体系与上述（4)杂交产物混合用于测序反应；
[00測（7)将上述化）的反应体系置于焦测序仪（PSQ96MA system (Biotage AB，化psala，Sweden))中，按照表1的顺序依次分别加入两核巧酸进行焦测序，得到由按照 先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息图2(根据表1的理论计算，如果单步测 序反应合成核巧酸的数目超过5个，则设定进行两次反应，W避免合成反应部完全）；根据 图2提取。、。3、。5、町。9转化为核巧酸数目的信息巧311的峰强度相当于一个核巧酸），便可 W求出Xi=0. 31、X2= 0. 42、X3= 0. 37、X4= 0. 47、X5= 0. 51，即为五个位点的甲基化程 度。
[0039] 表1. 100%甲基化或未甲基化PCR产物DNA模板的理论测序结果
[0040]
阳〇41 ] 注：AT表示（dATP a S+dTTP)，依次类推
[0042] DNAl表示100%甲基化序列：C
[0043] DM2表示100%未甲基化序列
[0044] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：步骤包括：1)DNA提取；2)亚硫酸 氢盐处理；3)PCR扩增；4)测序；5)关联分析； 所述步骤4)的测序方法为：按照特定两核苷酸、dGTP加入方式进行焦测序；其中，两核 苷酸测定序列反应得到合成数目的编码信息，dGTP测定序列反应得到合成数目信息。2. 根据权利要求1所述的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所述步骤4)的 具体方法包括以下步骤： 4-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰 的DNA链固定到所述磁珠上，在0. 05-0. 2M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA链清 除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板； 4-2)测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80°C下放 置5-10min，自然冷却至室温，完成杂交； 4-3)测序：配备测序反应体系，与所述步骤4-2)得到的杂交产物混合，焦测序反按照 特定两核苷酸、dGTP加入方式进行。3. 根据权利要求2所述的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所述步骤4-2) 中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的一段序列。4. 根据权利要求1或2所述的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所述步骤 4)中，两核苷酸每个测序反应获得两核苷酸合成测序的信号强度信息，dGTP每个测序反应 获得单个核苷酸合成测序的信号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比， 即每个测序反应的测序信号强度均可以转化为核苷酸合成的数目。5. 根据权利要求1所述的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所述步骤5) 中，根据焦测序得到的dGTP每个测序反应获得的核苷酸合成的数目信息，该数目信息是包 为0彡X1S1 ; 所述关联分析为：假定容易一个GC位点中C被甲基化的程度为X1，其中0彡X1S1， 那么，在经过亚硫酸氢盐处理的PCR产物这个碱基序列中，含有"C"的DNA模板序列含量为 X1，而含有由这个碱基未被甲基化转化而来的"T"DNA模板序列含量则为（I-X1);根据dGTP 测序反应得到的核苷酸合成的数目信息，即可求出Xi的数值。6. 根据权利要求1所述的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所述步骤2) 中，采用传统的亚硫酸氢盐转化方法，或者采用市售的试剂盒、按照其操作流程实施。7. 根据权利要求1所述的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所述步骤3) 中，PCR扩增所用的PCR-条引物为5'端被生物素、氨基或者丙烯酰胺基团修饰，与表面修 饰链霉亲合素、羧基的固相载体反应，或者与丙烯酰胺单体聚合反应制备单链DNA模板。8. 根据权利要求1或2所述的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：其 特征在于：所述特定两核苷酸是依据DNA模板分析片段确定的，包括（dCTP+dTTP)、 (dATPaS+dCTP)、（dATPaS+dTTP)。
【专利摘要】本发明公开了一种焦测序定量检测甲基化的方法。该方法将基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后的PCR产物按照特定两核苷酸快速通过DNA模板序列中“A”、“G”、“T”区域，而dGTP加入测定DNA模板序列中“C”含量方式进行焦测序，连续记录每个测序反应得到信息：即得到两核苷酸合成数目的编码和dGTP合成数目信息，通过设定已确定的目标区域序列中所有GC位点中碱基C均不同程度的转化成T，再利用dGTP合成数目信息，实现目标区域序列中各甲基化位点的定量分析。本发明能够大幅度提高测序长度，拓宽了传统焦测序的分析范围，适合单样本PCR产物、以及混合样本PCR产物序列的甲基化定量分析。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105219851
【申请号】CN201510621381
【发明人】肖鹏峰, 陈玲
【申请人】东南大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月25日