可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌的双重lamp方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及病原弧菌的检测方法，具体的说是一种可同时检测副溶血弧菌和创伤 弧菌的双重LAMP方法。
【背景技术】
[0002] 创伤弧菌（Vibriovulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，主要分布于近海海洋 环境中，是水产养殖邮、蟹和牡颇等水生动物中最常见、流行最广、危害最严重的致病菌之 一；副溶血弧菌（VibrioPar址emolyticus)，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种 形状，广泛存在于海水和海产品中，是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。
[0003] 环介导等溫扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000 年由Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术，该技术根据祀序列设计四条特异性 引物，可W特异性识别祀序列的六个特定区域，在等溫条件下，通过BstDNA聚合酶的链置 换和链延伸作用，可W在1小时内对祀序列实现109倍的扩增，扩增产物加入巧光染料SYBR GreenI后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可W通过肉眼直接观察。目前，针对创伤弧菌 和副溶血弧菌已经有LAMP检测方法的报道，只是运些检测方法均是针对单一致病菌进行 的检测。双重或多重LAMP技术相对单重LAMP而言，操作更加快速、简便，并且节约检测成 本，适合基层养殖场对病原的快速检测。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种可同时检测创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP检测方法，目 的是实现对创伤弧菌和副溶血弧菌进行特异、灵敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测 技术只能检测单一病原的弊端。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案予W实现： 1、 提供2组LAMP引物序列，创伤弧菌的引物长度分别为45bp，4化P，20bp，19bp， 分另ll命名为metalloprotease-FIP、metalloprotease-BIP、metalloprotease-F3、 metallop;rotease-B3,副溶血弧菌引物长度分别为47bp，44bp，19bp，22bp，分别命名为 ompA-FIP、ompA-BIP、ompA-F3、ompA-B3 ; 2、 配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳反应体系和 反应条件； 3、 反应产物的鉴定：2%琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI，观察反应管中颜色 变化。
[0006] 具体包括如下步骤： 1、设计LAMP引物：根据GeneBank中已知V.vulnifi州S的metalIoprotease基因 (GenBank:呪0548. 1)和V.par址aemolyticus的ompA基因（GenBank:JTGT01000603. 1) 作为祀序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物，对于 V.vulnificus,在BIP的Blc和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的Flc和F2之间添 加-TTTT-连接子；V.par址aemolyticus，在BIP的Blc和B2之间添加PstI酶切位点，在FIP的Flc和F2之间添加-TTTT-连接子，设计W下两组LAMP引物：
2、配制LAMP反应体系 反应体系的终浓度为：总体系25^1，包括BstDNA聚合酶IyI(SU),IOXBstDNA Buffers. 5y1，PCR级甜菜碱 4yU5M)，dNTPs(2. 5mMeach) 2. 5y1，创伤弧菌和副溶血弧 菌DNA模板共计1y1，FIP/BIP各1y1 (0. 8yM)，F3/B3各1y1 (0. 2yM)，加灭菌双蒸水使 反应体系总体积达到25y1。
[0007] 3、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应溫度58到65°C，反应 时间为15到90min。
[0008] 4、扩增产物检测：2%琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI，观察反应管中颜 色变化。
【附图说明】
[0009] 图1反应溫度溫度梯度从左往右依次58°C到65°C8个梯度1，3, 5, 7,9,11，13， 15 分别为 58°C，59°C，60°C，ere，62°C，63°C，64°C，65°C的阴性对照；2,4,6,8,10,12,14， 16分别为58。C，59。C，60。C，6^C，62。C，63。C，64。C，65。C加模版。M:marker 图 2 反应时间I-6 分别代表 15min, 30min, 45min, 60min, 75min, 90min;M为marker图3双重LAMP反应的琼脂糖凝胶电泳图谱及酶切分析 图4创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP检测方法与普通PCR检测方法的灵敏度比较MiMarker； 1-81.6X107CFU/ml-l. 6XlOOCFU/mlCFU/ml；N:negativecontrol 图5特异性结果统计只有创伤弧菌和副溶血弧菌有扩增，其他菌均没有扩增 图6SYBRGreenI显色反应对人工感染的大菱解鱼的肝、肾、脾、血进行双重LAMP扩 增，产物加入SYBRGreenI，感染组显示绿色（+)，对照组无变化（-)。 图7双重LAMP检测方法的应用-平板计数法结合双重LAMP计数细菌的最低检出率。
【具体实施方式】
[0010] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0011] 实施例1 1.创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP方法的建立 1. 1材料 dNTPs、BstDNA聚合酶（含IOX缓冲液）、PCR级甜菜碱、 1. 2方法 1.2. 1引物设计与合成 设计LAMP引物：根据GeneBank中已知V.vulnifi州S的metalIoprotease基因 (GenBank:呪0548. 1)和V.par址aemolyticus的ompA基因（GenBank:JTGT01000603. 1) 作为祀序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物，对于 V.vulnificus,在BIP的Blc和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的Flc和F2之间添 加-TTTT-连接子；V.par址aemolyticus,在BIP的Blc和B2之间添加PstI酶切位点，在 FIP的Flc和F2之间添加-TTTT-连接子，设计W下两组LAMP引物：
1. 2. 2LAMP扩增条件的优化 优化反应溫度和反应时间：检测所用的模板用煮沸裂解法制备。分别在溫度和时间上 设置的不同梯度，进行优化。溫度上从58°C到65°C每隔rC设置一个梯度；时间上15min- 个梯度，设置6个梯度。扩增产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳分析； 分析溫度电泳图：创伤弧菌在58°C到65°C均可发生反应，产生阶梯状扩增条带，且电 泳条带亮度接近；副溶血弧菌在58 °C和65 °C均无明显阶梯状扩增条带，但在59 °C到64°C有 阶梯状扩增条带。（见图I-A和图1-B) 分析时间电泳图：创伤弧菌和副溶血弧菌均在45min时，出现明显的阶梯状条带，（见