一种苜蓿褐斑病的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及苜蓿栽培领域，具体涉及一种苜蓿褐斑病的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]苜蓿是优良的豆科牧草，种植范围广泛，褐斑病是我国苜蓿的重要病害，严重影响苜蓿的产草量和品质。鉴定和评价苜蓿对褐斑病的抗病性，是培育和利用抗病品种防治苜蓿褐斑病的基础。抗病性鉴定中最难解决的一个问题是如何提高大批量筛选的效率。
【发明内容】
[0003]为解决上述问题，本发明提供了一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，通过合理的培育接种方法，以及合理的培养基配方，提高了鉴定的效率，且可用于大批量的筛选。
[0004]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
[0005]—种苜蓿褐斑病的鉴定方法，包括如下步骤:
[0006]S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mmX 3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有0.7-1.1 %的青霉素或链霉素的去离子水浸洗4-6s，用含有0.025%的升汞和0.15?0.25%吐温混合液浸泡2?5min，用无菌水清洗5?8次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；
[0007]S2、将所得的组织块置于培养基上，于20_30°C恒温培养箱中进行培养，36_72h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；
[0008]S3、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7-10d后，用40?60mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；
[0009]S4、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50 μπι/mL苯骈咪唑的0.3%水琼脂培养基上培养4天；
[0010]S4、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100%，温度20°C，无光照的条件下，接种20h ；
[0011 ] S5、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000Iux和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22°C，无光时培养温度为18°C，每天观察记录侵染及病害发展情况。
[0012]其中，所述步骤S2中的培养基的配方为:稀释O?4倍的有机物、葡萄糖浓度为O?20g/L、NH4N03浓度为O?2.5g/L、pH为4.0?8.0、琼脂浓度为10?30g/L。
[0013]其中，所述有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇 27mg/L。
[0014]其中，所述步骤S2中新的PDA平板培养基包括PDA培养基的营养物质、COD及其金属离子，营养物质包括氮、磷、碳，金属离子包括铜、猛、钠、1丐、钾、镁、铁。
[0015]其中，所述步骤S2中新的PDA平板培养基中还添加有营养液。
[0016]其中，所述营养液配方为葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氢钾1.5g、氨基酸螯合猛50mg、硫酸锌50mg，水1000ml。
[0017]本发明具有以下有益效果:
[0018]通过合理的培育接种方法，以及合理的培养基配方，提高了鉴定的效率，且可用于大批量的筛选。
【具体实施方式】
[0019]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020]实施例1
[0021]S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mmX3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有0.7%的青霉素或链霉素的去离子水浸洗4s，用含有0.025%的升萊和0.15%吐温混合液浸泡2min，用无菌水清洗5次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；
[0022]S2、将所得的组织块置于培养基上，于20°C恒温培养箱中进行培养，36h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；其中，所使用的培养基的配方为:盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇27mg/L，pH为4.0?8.0、琼脂浓度为10g/L ;所使用的PDA平板培养基包括PDA培养基的营养物质、营养液、COD及其金属离子，营养物质包括氮、磷、碳，金属离子包括铜、猛、钠、1丐、钾、镁、铁，营养液配方为葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氢钾1.5g、氨基酸螯合锰50mg、硫酸锌 50mg，水 1000ml。
[0023]S3、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7d后，用40mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；
[0024]S4、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50 μπι/mL苯骈咪唑的0.3%水琼脂培养基上培养4天；
[0025]S4、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100%，温度20°C，无光照的条件下，接种20h ；
[0026]S5、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000Iux和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22°C，无光时培养温度为18°C，每天观察记录侵染及病害发展情况。
[0027]实施例2
[0028]S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mmX 3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有1.1 %的青霉素或链霉素的去离子水浸洗6s，用含有0.025%的升汞和0.25%吐温混合液浸泡5min，用无菌水清洗8次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；
[0029]S2、将所得的组织块置于培养基上，于30°C恒温培养箱中进行培养，72h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；其中，所使用的培养基的配方为:稀释4倍的有机物、葡萄糖浓度为20g/L、NH4N03浓度为2.5g/L、pH为8.0、琼脂浓度为30g/L ;所述有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇27mg/L ;所使用的PDA平板培养基包括PDA培养基的营养物质、营养液、COD及其金属离子，营养物质包括氮、磷、碳，金属离子包括铜、猛、钠、1丐、钾、镁、铁，营养液配方为葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氢钾1.5g、氨基酸螯合锰50mg、硫