酸锌50mg，水 100ml。
[0030]S3、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7-10d后，用40?60mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；
[0031]S4、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50 μπι/mL苯骈咪唑的0.3%水琼脂培养基上培养4天；
[0032]S4、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100%，温度20°C，无光照的条件下，接种20h ；
[0033]S5、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000Iux和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22°C，无光时培养温度为18°C，每天观察记录侵染及病害发展情况。
[0034]实施例3
[0035]S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mmX3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有0.9%的青霉素或链霉素的去离子水浸洗5s，用含有0.025%的升萊和0.2%吐温混合液浸泡3.5min，用无菌水清洗6.5次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；
[0036]S2、将所得的组织块置于培养基上，于25°C恒温培养箱中进行培养，54h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；其中，所使用的培养基的配方为:稀释2倍的有机物、葡萄糖浓度为10g/L、NH4N03浓度为1.25g/L、pH为6.0、琼脂浓度为20g/L ;有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇27mg/L ;所使用的新的PDA平板培养基包括PDA培养基的营养物质、营养液COD及其金属离子，营养物质包括氮、磷、碳，金属离子包括铜、锰、钠、钙、钾、镁、铁，营养液配方为葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氢钾1.5g、氨基酸螯合猛50mg、硫酸锌50mg，水 100ml ο
[0037]S3、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7_10d后，用40?60mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；
[0038]S4、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50 μπι/mL苯骈咪唑的0.3%水琼脂培养基上培养4天；
[0039]S4、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100%，温度20°C，无光照的条件下，接种20h ；
[0040]S5、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000Iux和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22°C，无光时培养温度为18°C，每天观察记录侵染及病害发展情况。
[0041]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤: 51、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mmX 3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有0.7-1.1 %的青霉素或链霉素的去离子水浸洗4-6s，用含有0.025%的升汞和0.15?0.25%吐温混合液浸泡2?5min，用无菌水清洗5?8次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分； 52、将所得的组织块置于培养基上，于20-30°C恒温培养箱中进行培养，36-72h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物； 53、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7-10d后，用40?60mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液； 54、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50ym/mL苯骈咪唑的0.3%水琼脂培养基上培养4天； 54、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100 %，温度20°C，无光照的条件下，接种 20h ； 55、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度90001uX和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22°C，无光时培养温度为18°C，每天观察记录侵染及病害发展情况。2.根据权利要求1所述的一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S2中的培养基的配方为:稀释O?4倍的有机物、葡萄糖浓度为O?20g/L、NH4N03浓度为O?2.5g/L、pH为4.0?8.0、琼脂浓度为10?30g/L。3.根据权利要求2所述的一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，其特征在于，所述有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸卩比卩多醇3mg/L、肌醇35mg/L、环已六醇27mg/L。4.根据权利要求1所述的一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S2中新的PDA平板培养基包括PDA培养基的营养物质、COD及其金属离子，营养物质包括氮、磷、碳，金属离子包括铜、锰、钠、钙、钾、镁、铁。5.根据权利要求1所述的一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S2中新的PDA平板培养基中还添加有营养液。6.根据权利要求5所述的一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，其特征在于，所述营养液配方为葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氢钾1.5g、氨基酸螯合猛50mg、硫酸锌50mg，水 100ml ο
【专利摘要】本发明公开了一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，包括如下步骤：病原体分离后置于PDA培养基平台上培养，用无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50μm/mL苯骈咪唑的0.3％水琼脂培养基上培养4天；选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100％，温度20℃，无光照的条件下，接种20h；接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000lux和黑暗每12h交替一次，每天观察记录侵染及病害发展情况。本发明通过合理的培育接种方法，以及合理的培养基配方，提高了鉴定的效率，且可用于大批量的筛选。
【IPC分类】C12R1/645, C12Q1/18
【公开号】CN105219835
【申请号】CN201510681566
【发明人】刘香萍, 李国良, 杨智明, 曲善民
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月13日