，对于反应强烈的可以 直接从扫描图片上荧光的反应判断检测结果。
[0045] 如上所述的一种基因芯片的制备方法，其特征在于步骤D中配制1 OuL杂交液包括 100%甲酰胺5此，10%503 0.21^，2(^55(：1.51^，？0?样品标记物3.311匕
[0046] 如上所述的一种基因芯片的制备方法，其特征在于步骤F中利用基因芯片激光共 聚焦扫描仪扫读芯片信息的具体步骤:先打开扫描软件，然后开仓，将芯片插入机器内，关 仓，使用绿色荧光通道，先使用4伪彩进行预扫一次，以便选择扫描区域，再进行精扫，扫描 参数为扫描分辩率为ΙΟμπι，激发光源波长532nm，接收的荧光信号中心波长570nm，检测灵敏 度小于一个荧光分子/ um2,激光功率值Laser Power 100%，光电倍增管效率值PMT Gain 600 〇
[0047]如上所述的一种基因芯片的制备方法，其特征在于步骤B3中所述PPV-chip-Pl的 序列：
[0048] 5'-CCCATTTTCACRCCAGCARC-3' Tm = 61.8;其中R表示碱基G或者A;
[0049] 即PPV-chip-Pl的序列有四种情况：
[0050] 1、PPV-chip-卟1:5 '-CCCATTTTCACGCCAGCAGC-3 '；
[0051 ] 2、PPV-chip-Pl-2:5'-CCCATTTTCACGCCAGCAAC-3'
[0052] 3、PPV-chip-Pl-3:5 '-CCCATTTTCACACCAGCAGC-3 '
[0053] 4、PPV-chip-Pl-4:5 '-CCCATTTTCACACCAGCAAC-3 '
[0054] 所述PPV-chip_P2的序列为：
[0055] 5'-TCGCATGATCCAACAATGGC-3' Tm = 59.8。
[0056] 如上所述的一种基因芯片的制备方法，其特征在于步骤A中所述点样的具体做法： 按阵列排布的方式点样，点与点的中心距离为740μηι，点的直径为500μηι，样品包括探针、定 位基因阳性对照、DMS0阴性对照及三蒸水空白对照，每个样品点20个重复点，每块玻片点两 个重复阵列。
[0057] 一种采用如上所述的基因芯片检测李痘病毒的方法，其特征在于包括以下步骤： [0058]对检测样品进行PCR扩增，得到标记有荧光染料的待检测样品的基因组DNA，然后 同基因芯片进行杂交，荧光标记的DNA分子与基因芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应， 使得芯片上的点呈现出荧光信号；根据探针在芯片上的特定位置排布，通过机器扫描和软 件分析推断出相应被测样品的相关信息，鉴定出被测样品病毒株系的种类。
[0059]本发明中采用的材料
[0060] 1 · 1材料
[0061] 1.1.1毒株来源
[0062] D(Dideron)株系：Tey(X16415)、PENN2(AF401296)、Fan(AY912056)、Rankovic (M21847)、Skiernevice(S73776);
[0063] M(Marcus)株系：SK68(M92280)、PS(AJ243957)、06(S57405)、S57404(1768bp)
[0064] EA(E1 Amar)株系：X56258，AM157175
[0065] C(Cheery)株系：Y09851、AY184478、X97398
[0066] W(Winona)株系：AY912055
[0067] Rec(Recombinants between D and M)株系：AY028309
[0068] 以上株系均购自美国GADIA公司，其标准序列来自NCBI http :// www.ncbi.nlm.nih.gov。
[0069] 用通用引物对六个株系分别进行PCR扩增，以检测通用引物的实用性和特异性。
[0070] 本发明主要内容是首先根据李痘病毒的6个主要株系即D、M、EA、C、W和Rec株系的 基因序列比较，找出它们各自的核酸特殊序列，然后根据各自的特殊核酸序列设计出检测 它们的特异性核酸探针;并在各自探针两侧设计通用的PCR引物，在引物合成过程中对其5' 端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dCTP;然后将两种不同的特异性同时点样 在同一张芯片上制成微阵列芯片。对检测样品进行PCR扩增，即可得到标记有荧光染料的待 检测样品的基因组DNA，然后同含有待检测样品特异探针的微阵列芯片进行杂交，荧光标记 的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号。根 据探针在芯片上的特定位置排布，通过机器扫描和软件分析就可以推断出相应被测样品的 相关信息，鉴定出被测样品病毒株系的种类。本项目预期达到的最终目标是研制出一次同 时能够高通量检测李痘病毒主要株系的基因芯片和检测方法。
[0071] 综上所述，本发明的有益效果：
[0072] -、本发明中李痘病毒各主要株系的通用引物能够一次性扩增6个株系中的任何 一个株系，而不需要做多重PCR，标记的扩增片段即可同芯片进行杂交，不但可以检测出李 痘病毒，而且还能够明确是该病毒的哪个株系，检测结果直观明了，易于判定。
[0073]二、本发明基因芯片特异性好，能够正确区分6个株系，而且与其它植物病毒没有 交叉反应。
[0074]三、本发明基因芯片的灵敏度高，可达到5pg/yL DNA模板浓度。
【附图说明】
[0075] 图1为本发明中PPV不同株系PCR扩增电泳图；其中，M: 100bp marker，1 .PPV strain D；2.PPV strain M；3.PPV strain EA；4.PPV strain C；5.PPV strain ff；6.PPV strain Rec;7.CK-；图2为本发明PPV D株系检测结果；图3为本发明PPV M株系检测结果； 图4为本发明PPV C株系检测结果；图5为本发明PPV EA株系检测结果；图6为本发明PPV W株 系检测结果；图7为本发明PPV Rec株系检测结果；图8为芯片灵敏度试验结果，其中A: 20pg/ yL; B: lOpg/yL; C: 5pg/yL; D: 2 · 5pg/yL;图9为李坏死环斑病毒PNRSV标记PCR扩增;M: 100bp 分子量标准；1. PNRSV及PPV二重PCR扩增产物2. PPV PCR扩增产物;3. PNRSV PCR扩增产物， 675bp;图10为应用芯片对植物病毒李坏死环斑病毒的验证检测。
【具体实施方式】
[0076]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0077] 实施例1
[0078] -种李痘病毒主要株系杂交探针，包括：
[0079] PPV-D:5 '-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3，
[0080] PPV-Μ:5 '-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3，
[0081 ] PPV-EA:5 '-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3 '
[0082] PPV-Re c:5 '-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3 '
[0083] PPV-W:5 '-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3 '
[0084] PPV-C:5 '-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3 '。
[0085] 实施例2
[0086] -种基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
[0087] A、制备基因芯片点样：
[0088]取5ul纯化探针，加点样液5ul混匀，探针浓度为ΙΟμπι;加到点样仪，将寡核苷酸探 针点在醛基玻片上，并通过探针5 '末端的氨基基团进行共价固定；
[0089]其中所述探针包括：
[0090] PPV-D:5 '-CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3，
[0091 ] PPV-Μ:5 '-CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3，
[0092] PPV-EA:5 '-CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3 '
[0093] PPV-Re c:5 '-CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3 '
[0094] PPV-W:5 '-GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3 '
[0095] PPV-C:5 '-ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3 '；
[0096] B、PCR扩增与样品标记：
[0097] B1、感病植物总RNA提取；
[0098] 称取0. lg感病植物组织样品，然后按照Trizol试剂盒方法提取样品总RNA;
[0099] B2、反转录；
[0100] 在装有去离子水9.5yL的0.2mL PCR管中，加入B1中提取的样品总RNA 2yL，01igo (dT)150.5yL，d