专利名称：呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。
背景技术：
硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药动力学的特征，曾经被广泛应用作为畜、禽、人工养殖水产品的促生长添加剂。但通过长期的实验室研究发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可使实验动物发生癌变和基因突变，并由此推断，人类长期使用该类药物或长期食用添加该类促生长剂的畜、禽、人工养殖水产品，同样也可发生癌变和基因突变，所以此类药物禁止在治疗动物疾病和饲料中使用。
我国于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令，在农业部发布的193号公告的《食品动物禁用兽药及其它化合物清单》中，硝基呋喃类抗生素在所有食品动物和所有用途中都被禁止使用。欧盟委员会于2003年通过了 2003/181/EC委员会决议，建立了用于检测禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物的代谢物和各种方法的最小要求性能限值 (Minimum Required Performance Limits, MRPL)为 I μ g/kg,欧盟从第三国进口的动物性产品中硝基呋喃类药物的代谢物的含量不得超过I μ g/kg。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃它酮。因此，为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展，必须确立准确可靠，灵敏度高的定性定量方法。据申请人了解，申请号为200610127111.4，申请日为2006年9月7日，名称为《单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法及其应用》的中国发明专利申请中，公开了利用呋喃它酮的单克隆抗体检测呋喃它酮残留，由于呋喃它酮在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物是5-吗啉基甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)则能存留较长的一段时间，所以该方法不能够准确地检测呋喃它酮的残留。因此在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，检测监管部门就以检测代谢物为手段达到检测呋喃它酮残留的目的。目前用于呋喃它酮残留标示物AMOZ的检测方法有液液萃取-高效液相色谱、固相萃取_高效液相色谱法、 液相色谱质谱联用仪方法等。由于仪器方法所需仪器价格昂贵，耗时长，对操作人员的要求较高，难于在基层单位推广，不适合高通量的样品快速筛选。发明内容
本发明要解决技术问题是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种呋喃它酮代谢物衍生物的单克隆抗体，并将该单克隆抗体应用于检测呋喃它酮代谢物残留。该方法具有操作简便、成本低廉、高通量、特异性强的特点。
本发明所涉及的杂交瘤细胞株4B10已于2011年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No. 5073，分类命名为抗呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
由以上杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体命名为4B10’，其制备步骤如下a.制备免疫原和包被原采用间醛基苯甲酸法将载体蛋白与呋喃它酮代谢产物小分子偶联，合成免疫原和包被原；b.动物免疫注射以Balb/c鼠作为免疫动物，免疫途径为颈背部皮下多点注射，融合前的超强免疫途径为腹腔免疫；c.筛选动物免疫血清用间接酶联免疫吸附法和竞争间接酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；d.制备杂交瘤细胞取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经过亚克隆获得可以稳定分泌抗呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B10 ；e.制备并纯化单克隆抗体对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞4B10，采集腹水，对腹水进行液相层析纯化，获得呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体4B10’。
其中，步骤a所述载体蛋白为牛血清白蛋白和卵清白蛋白，对应的免疫原为 AMOZ-BSA,包被原为AMOZ-OVA ;所述间醛基苯甲酸法中，交联剂活化载体小分子衍生物的时间为广2 h，用呋喃它酮代谢物小分子衍生物与载体蛋白偶联反应1(T15 h。所述步骤b 中的各次免疫注射剂量为100 μ g/只。所述步骤e中对免疫小鼠腹腔进行单克隆抗体细胞株的注射量为(I 5) X IO6个/只。
通过亚型鉴定得出本发明单克隆抗体的亚型为IgGl型。
常规制备呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体的方法主要是通过药物的羧基与载体蛋白的氨基偶联，本发明是将呋喃它酮代谢物小分子通过间醛基苯甲酸进行衍生化并将衍生产物的羧基通过混合多元酸酐法与载体蛋白的氨基偶联，这样，该法合成的完全抗原， 通过“交联臂”间醛基苯甲酸的作用，可以将呋喃它酮代谢物小分子充分暴露出来，使机体更容易识别该抗原决定簇，提高抗原的免疫原性，在后期筛选过程中可以获得针对呋喃它酮代谢物衍生物的抗体。呋喃它酮代谢物衍生物结构式如下HOOC 本发明的再一个目的是提供该单克隆抗体在制备检测呋喃它酮代谢物中的应用，主要是将其应用于制备呋喃它酮代谢物残留的检测试剂盒和胶体金试条纸。
本发明的有益效果是通过小鼠杂交瘤细胞株4B10产生的单克隆抗体4B10’，该抗体与其它呋喃类代谢物衍生物交叉反应率低，能够大量生产，并可用于制备检测呋喃它酮代谢物的酶联免疫分析法试剂盒和胶体金试纸条，达到快速、特异、且灵敏地检测牛奶， 肌肉及水产品中的呋喃它酮代谢物残留的目的，为检测呋喃它酮代谢物残留的试剂盒研制奠定基础。
图I为本发明实施例一中免疫原的OD335标准曲线。
图2为本发明实施例一中包被原的OD335标准曲线。
具体实施方式
实施例一试剂与材料准备盐酸呋喃它酮(AM，上海安谱科学仪器有限公司，C13963000)呋喃它酮代谢物(ΑΜ0Ζ， 上海安谱科学仪器有限公司，⑶E0-NF003);间醛基苯甲酸(Alfa B21277) ；DMF (sigma, D4551)，牛血清白蛋白(BSA) (Jackson，001-000-173)，卵清白蛋白(OVA) (Sigma, A5503), 弗氏完全佐剂(Sigma, F5881)，弗氏不完全佐剂(Sigma, F5506)，四甲基联苯胺(TMB) (Amresco, 0759)，HAT (Sigma, H0262)和 HT (Sigma, H0137)，氯化钠(Amresco, 0241)，氯化钾(Amresco, 0395),磷酸二氢钾(Sigma, P9791),磷酸氢二钠(Sigma, 71639),羊抗鼠 IgG-HRP (Jackson, 115-035-044)，二甲基亚砜(DMSO) (Applichem, 0231)，聚乙二醇 4000 (PEG4000) (Sigma, P7306), DMEM 高糖培养基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco, C20270)。
实验动物与细胞Balb/c鼠(6-8周龄，雌性)，购自扬州大学动物中心，SP2/0 (小鼠骨髓瘤细胞)由中科院生物物理研究所感染与免疫研究中心唐捷教授惠赠。
本发明的实验步骤如下a. 制备免疫原AMOZ-BSA和包被原AM0Z-0VA 本发明所述的人工抗原采用间醛基苯甲酸法将AOMZ衍生化，并利用AMOZ衍生物上的羧基和载体蛋白上的氨基进行偶联，从而合成呋喃它酮抗原。
—、完全抗原合成I、将2 mg呋喃它酮代谢产物小分子标准品与2. 7 mg间醛基苯甲酸在I. 5 mL吡啶溶液中15°C震荡反应24 h。
2、将反应液经旋转蒸发仪蒸干后溶于400 μ L DMF溶液中，加三丁胺5 μ ，冰浴振汤10 min后，加氣甲酸异丁酷3 μ I冰浴振汤I h。
3、于冰浴条件下将反应产物缓慢滴加入BSA溶液或OVA溶液，滴加完毕后4°C搅拌反应24 h。
4、在 0. 01 M pH 7. 4 的 PBS 中透析。
二、免疫原及包被原偶联比测定免疫原与包被原偶联比测定方法三硝基苯磺酸法(TNBS法)，具体过程如下I、将载体蛋白BSA或OVA溶解在0. I Μ,ρΗ 8. 5碳酸氢钠溶液中，配制成O μ g/mL, 20 μ g/mL, 40 μ g/mL, 60 μ g/mL, 80 μ g/mL, 100 μ g/mL, 120 μ g/mL 共 7 个浓度梯度(用于绘制标准曲线)；同时，将待测样品按同样的方法配制成150 μ g/mL的浓度。
2、将TNBS溶解于0. I M，pH 8. 5碳酸氢钠溶液中，配制成0. 01% (w/v)溶液。
3、将0. 5 mL TNBS溶液分别加入I mL 6个标样和I个待测样品中，混匀，37°C下孵育2 h。
4、在上述 7 个样品中加入 0. 5 mL 10% SDS 和 0. 25 mL I N HCL。
5,335 nm处测定各样品的OD值，绘制标准曲线并计算待测样品中伯胺含量。
表I BSA与OVA标准样的OD33权利要求
1.一种产生呋喃它酮代谢物衍生物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B10，是小鼠杂交 瘤细胞系 CGMCC No. 5073。
2.根据权利要求I所述杂交瘤细胞株4B10产生的单克隆抗体4B10’。
3.根据权利要求2所述单克隆抗体4B10’，其特征在于所述单克隆抗体亚型为IgGl型。
4.根据权利要求2所述单克隆抗体4B10’在检测呋喃它酮代谢物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明的呋喃它酮代谢物衍生物单克隆抗体4B10’是由小鼠杂交瘤细胞株4B10产生，其亚型是IgG1型。本发明的有益效果是通过小鼠杂交瘤细胞株4B10产生的单克隆抗体4B10’，能够大量生产，可用于制备检测呋喃它酮代谢物的酶联免疫分析法试剂盒和胶体金试纸条，达到快速且灵敏地检测肌肉、牛奶、及水产品中的呋喃它酮代谢物的目的。
文档编号C12N5/20GK102936583SQ201210335960
公开日2013年2月20日 申请日期2012年9月12日 优先权日2011年9月23日
发明者唐宏, 崔迎利, 王晓艳 申请人:泰州康正生物技术有限公司